一种调控嵌合抗原受体表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控嵌合抗原受体表达的方法，表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法表达，当向表达体系加入非天然氨基酸时，完整表达嵌合抗原受体。本发明专利技术所述的具有非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体保持了CAR‑T的靶向性和杀伤性的同时对此两种特性增加了控制性，将控制性开关选择为小分子化合物，为CAR‑T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

【技术实现步骤摘要】
一种调控嵌合抗原受体表达的方法
本专利技术涉及生物医学转化领域，尤其涉及一种具有非天然氨基酸依赖的调控嵌合抗原受体表达的方法。技术背景癌症作为公共健康问题，其发病率和死亡率逐年攀升，癌症已经成为最主要的死亡原因之一。过继性免疫疗法是在传统手术治疗、放射疗法和化学疗法之外，以提高人体对肿瘤的免疫效应的重要治疗方案。过继性细胞免疫治疗（adoptivecellularimmunotherapy，ACI）是指将体外激活的自体或异体免疫细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞，是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一，已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。其中，嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor，CAR）T细胞治疗法是近年来发展非常迅速的一种新的细胞免疫治疗技术，通过基因工程技术修饰效应T细胞，克服肿瘤局部免疫抑制微环境和宿主免疫耐受状态，提高了抗肿瘤的靶向性、杀伤性和持久性。CAR结构由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区组成。胞外抗原结合区主要是抗原特异性单克隆抗体单链的重链（VL）和轻链（VH）的可变区组成，二者以铰链区连接形成单链抗体（singlechainfragmentvarible，scFv）。CAR通过识别肿瘤抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM）”在体外进行基因重组，通过基因转染技术修饰患者的T淋巴细胞，使患者T淋巴细胞表达肿瘤抗原受体，经过纯化和大规模扩增修饰后的T淋巴细胞，称为嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞（CAR-T）。CAR技术临床上在血液系统肿瘤甚至实体瘤的治疗上取得了显著成绩，目前已经发展到第三代。第一代CAR由单链抗体通过跨膜区域与胞内信号传导区（ITAM）相连，ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ；第二代CAR的胞内信号传导区引入了共刺激分子（costimulatorymolecule，CM），主要为CD28分子；第三代CAR引入了双共刺激分子（CM1和CM2），主要为CD28分子加上CD134或CD137等。第一代CAR-T淋巴细胞研究较多，但是大多数试验在细胞扩增、体外存活时间、细胞因子分泌等方面还存在不足，没有达到预期的临床效果。研究表明，T淋巴细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号，通过CD28/B7等重要的共刺激分子，促进IL-2合成，并使T淋巴细胞充分活化及免于凋亡。即使T淋巴细胞与抗原接触，如果没有协同刺激信号，细胞难以发挥正常功能。相应的，仅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受体，如果没有协同刺激信号，也难以高效激活CAR-T淋巴细胞。因此，依照T淋巴细胞活化的双信号学说，第二代和第三代CAR在嵌合抗原受体上加上如CD28、CD137等共刺激分子，以提高T淋巴细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T淋巴细胞应答，延长T淋巴细胞存活时间等。研究证实第二代的CAR-T淋巴细胞在杀伤肿瘤活性和体内存活时间均优于第一代。目前，第三代CAR-T淋巴细胞临床应用还比较少，故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T淋巴细胞，以及选择怎样的共刺激分子组合，还需要进一步观察。虽然CAR-T靶向治疗肿瘤细胞是目前最有前景的癌症治疗方案之一，但是，当太多的信号转导达到阈值后，强烈引发的体内免疫应答可能会产生“细胞因子风暴”等重症，甚至引发患者死亡。因此，增加CAR-T细胞的活性“开关”控制是解决CAR-T毒性问题的重要内容，为CAR-T在临床的推广应用具有重要意义。
技术实现思路
非天然氨基酸是区别于20种常见的天然氨基酸的人工合成氨基酸，现已有多种在蛋白合成过程中编码非天然氨基酸的方法，最常见的是利用无义密码子UAG对其进行编码。通常情况下蛋白转录遇到无义密码子UAG终止信号即终止，但在特定情况下，即含有将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性氨酰tRNA合成酶和tRNA组合以及非天然氨基酸的情况下，翻译在UAG密码子处不终止，继续通读直到蛋白翻译结束。因此，可通过非天然氨基酸的添加与否调控开放阅读框中间含有UAG密码子的蛋白的完整表达。本专利技术针对现有技术不足，提供了一种嵌合抗原受体活性调控的解决方案，通过非天然氨基酸的添加与否来调控嵌合抗原受体的表达。本专利技术具体技术方案如下：一种调控嵌合抗原受体表达的方法，表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法完整合成表达，从而无法激活T细胞免疫反应；当向表达体系加入非天然氨基酸，且表达体系存在正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶正交性tRNA时，嵌合抗原受体能够正常合成，T细胞免疫应答通路完整。本专利技术所述的嵌合抗原受体，所以依赖的非天然氨基酸选自人工合成的α-氨基酸，优选选自Nε-Boc-L-赖氨酸、Nε-乙酰-L-赖氨酸、Nε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、Nε-烟酰基-L-赖氨酸、Nε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种。吡咯赖氨酸发现于产甲烷八叠球菌的甲烷甲基转移酶，区别于常见的20种的标准氨基酸，由终止密码子UAG有义编码写入蛋白。从吡咯赖氨酸的编码机制入手，科学家已经成功在细菌、哺乳动物细胞、真菌、昆虫、线虫等中编码超过70种人工合成的非天然氨基酸。例如Nε-Boc-L-赖氨酸、（Nε-苄氧羰基）-L-赖氨酸、Nε-乙酰-L-赖氨酸（Nε-acetyl-L-lysine，AcLys）、Nε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸（Nε-allyloxycarbonyl-L-lysine，AlocLys）、Nε-烟酰基-L-赖氨酸（Nε-nicotinoyl-L-lysine，NicLys）、Nε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸（Nε-(N-me-anthraniloyl)-L-lysine，NmaLys）、Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸（Nε-benzyloxycarbonyl-L-lysine，ZLys）等，本专利技术优选使用吡咯赖氨酸类似物—Nε-Boc-L-赖氨酸。编码UAG密码子的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸及其类似物氨酰化到识别UAG密码子的tRNA上。与非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶正交配对的tRNA能够识别UAG密码子且能够在配对氨酰tRNA合成酶的作用下将非天然氨基酸氨活化，形成tRNAPyl(Pyl-tRNAPyl)。本专利技术所述非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶源于天然可以编辑吡咯赖氨酸及其类似物的古生菌，包括但不限于Metbanosarcinabarkeri，Metbanosarcinamazei。优选来源于Metbanosarcinabarkeri的参与吡咯赖氨酸编码的氨酰tRNA合成酶和tRNA及其突变体。本专利技术所述的tRNA主要指与氨酰tRNA合成酶同种属来源的、携带吡咯赖氨酸及其类似物参与蛋白编码合成的tRNA，包括各种突变体，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控嵌合抗原受体表达的方法，其特征在于表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法表达，当向表达体系加入非天然氨基酸时，完整表达嵌合抗原受体。

【技术特征摘要】
1.一种调控嵌合抗原受体表达的方法，其特征在于表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法表达，当向表达体系加入非天然氨基酸时，完整表达嵌合抗原受体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述非天然氨基酸选自Nε-Boc-L-赖氨酸、Nε-乙酰-L-赖氨酸、Nε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、Nε-烟酰基-L-赖氨酸、Nε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述其特征在于所述嵌合抗原受体的信号肽的氨基酸密码子被突变为无义密码子。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述嵌合抗原受体的信号肽起始密码子AUG突变为UAG无义密码子。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用质粒或者病毒作为表达载体。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达载体包括嵌合抗原受体开放阅读框、正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶开放阅读框和正交tRNA表达盒。8.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：应述欢，高鹏，李玉霞，
申请(专利权)人：胜武北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11