一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法和应用技术

本发明专利技术公开一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法。该方法对雌性幼龄灵长类动物给予促性腺激素释放激素或其类似物，并联合给予促性腺激素，诱导卵泡发育并获得成熟卵母细胞，即为雌性配子；雄性幼龄灵长类动物给予促性腺激素，并联合给予促性腺激素释放激素或其类似物，诱导睾丸精子发生并获得精子即为雄性配子；通过对获得的雌性配子和雄性配子进行受精，使受精卵发育至囊胚或子代。本发明专利技术采用的组合激素完成诱导幼龄灵长类动物性早熟，提早获得性腺配子，显著缩短灵长类动物的世代周期，加速繁殖其后代。本发明专利技术可实现快速大量扩繁幼龄灵长类动物，缩短世代周期，降低费用，为珍贵、濒危动物种质资源保存及基因编辑动物快繁提供经验借鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法和应用。
技术介绍
众所周知，一个物种的基因信息会随着其灭绝而丢失，在濒危动物日渐增多的今天，如何安全有效地从幼龄濒危动物获取性腺配子进而获得试管动物是拯救濒危动物的一大难题。灵长类动物与人类基因同源性高，系统发育类似，而成为了生物医学研究的优秀实验模型。近年来由于基因突变导致的人类重大疾病越来越受重视，灵长类动物转基因模型也应运而生。随着基因编辑技术的不断革新，基因编辑变得越来越简易和高效。但得到的转基因灵长类动物往往为杂合子，或者靶基因序列不相同，要想得到靶基因序列相同的转基因灵长类动物就必须通过世代繁殖。自然情况下雌性食蟹猴3岁左右才能达到性成熟，雄性食蟹猴所需时间更长，一般要到4.5岁左右才能达到性成熟，以及食蟹猴孕期较长(约165天)，而且几乎均为单胎，这就决定了需要很长的时间才能得到子代转基因灵长类动物。诱导幼年动物性早熟是快速繁殖后代和保存物种的一种重要方法。目前对于性早熟的研究主要集中在雌性性早熟的治疗和与性早熟有关基因的探究方面。下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)是性早熟发生的基础机制。下丘脑-垂体-性腺轴在生殖系统形成时便已存在，性成熟前一直处于发育不健全状态，不能促进性腺发育和性源配子的产生。目前，可从幼龄灵长类动物获得性源配子的方法只有睾丸组织的异种移植(Liuetal.,Generationofmacaqueswithspermderivedfromjuvenilemonkeytesticularxenografts[J].CellResearch,2016,26(1):139-142)，但该方法有很大的缺陷：(1)首先需对幼猴进行睾丸切除，对幼猴的伤害无法恢复，且不能重复；(2)用时较长，移植12个月后才能获得性源配子；(3)提供睾丸组织的猴的年龄较大。目前，如何能在较短的时间内获得幼龄动物性腺配子，继而获得其囊胚或子代，又不对灵长类动物造成伤害的方法尚未见相关报道。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法。该方法采用组合激素的方法实现诱导幼龄灵长类动物性早熟，获得其精子或成熟卵母细胞，继而获得其囊胚或子代，这极大缩短灵长类动物世代周期，加速繁殖其后代，克服了灵长类动物幼龄在性成熟前神经内分泌器官发育不足的生殖生理现象，特别针对珍贵非人灵长类、基因编辑幼龄非人灵长类的快速繁殖。这不仅诱导灵长类动物幼龄的性早熟，而且快速繁殖其子代，节约时间并创造经济效益。本专利技术的目的通过下述技术方案来实现：一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法，包括以下具体步骤：S1.诱导雌性幼龄灵长类动物：(1)对雌性幼龄灵长类动物每天给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，直到诱导处理结束；(2)当血浆雌激素水平提高5～15倍后，同时给予促卵泡素；(3)在停止使用促卵泡素的当天，同时给予促性腺激素；(4)此后持续给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雌性幼龄灵长类动物卵巢卵泡发育；S2.对步骤S1诱导的雌性幼龄灵长类动物取卵泡液，获得卵母细胞，即为幼龄灵长类动物的雌性配子；S3.诱导雄性幼龄灵长类动物：(1)对雄性幼龄灵长类动物给予促性腺激素，(2)当血浆睾酮水平提高5～15倍或连续给予20～40天后，停止给予促性腺激素，并开始给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雄性幼龄灵长类动物睾丸精子发生；S4.对步骤S3诱导的雄性幼龄灵长类动物获取精液和精子，其精子即为幼龄灵长类动物的雄性配子。为了验证对上述步骤S2中所述的幼龄灵长类动物的雌性配子和步骤S4中所述的幼龄灵长类动物的雄性配子的发育能力，对雌性配子和雄性配子进行受精，受精卵发育至囊胚阶段，继而获得其囊胚或子代。在实施例中也证明组合激素诱导幼龄食蟹猴成功获得成熟性腺配子。显然地，上述方法可以显著缩短灵长类动物的世代周期，加速繁殖其后代。优选地，步骤S1(1)中所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量按幼龄动物的体重计为0.1～50微克/公斤/次，所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予的频率为1～288次/天，连续给予15～60天。优选地，步骤S1(2)中所述促性腺激素释放激素和促卵泡素的同时给予时间为6～12天，所述促卵泡素的每次给予量为5～35IU/公斤，所述促卵泡素的给予频率为1～4次/天；所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量和给予频率与步骤S1(1)中相同。优选地，步骤S1(3)中所述促性腺激素为人绒毛膜促性腺激素或促黄体素，所述促性腺激素按幼龄动物的体重计的给予量为100～500IU/公斤，只给予1次；所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量和给予频率与步骤S1(1)中相同；步骤S1(4)中所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量和给予频率与步骤S1(1)中相同。优选地，步骤S3(1)中所述促性腺激素为促黄体素、人绒毛膜促性腺激素或马绒毛膜促性腺激素，所述促性腺激素的每次给予量按幼龄动物的体重计为100～500IU/公斤，所述促性腺激素的给予频率为1～7次/周。优选地，步骤S3(2)中所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量按幼龄动物的体重计为0.1～50微克/公斤，所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予频率为1～288次/天，连续给予15～120天。优选地，步骤S1(1)和S3(3)中所述促性腺激素释放激素类似物为戈那瑞林、曲普瑞林或戈舍瑞林。优选地，步骤S1和S3所述幼龄灵长类动物为断乳后至性成熟前阶段的灵长类动物。更为优选地，所述的灵长类动物为恒河猴、食蟹猴、豚尾猴、日本猴或短尾猴。上述方法在非人灵长类、基因编辑幼年非人灵长类和濒危动物的保护中的应用。下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)是性早熟发生的基础机制。下丘脑-垂体-性腺轴在生殖系统形成时便已存在，性成熟前处于发育不健全状态，不能促进性腺发育和性源配子的产生。本专利技术使用的促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑分泌，刺激垂体促性腺激素的分泌，诱导性腺发育。在生殖器官组织中，促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)与GnRH的作用系统或相似，有些GnRHa的作用效果更加强烈，或者持续作用时间长。促性腺激素是调节脊椎动物性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素，如垂体前叶分泌的黄体生成素(又称促黄体素，LH)和促卵泡素(FSH)，两者协同作用，刺激卵巢或睾丸中生殖细胞的发育及性激素的生成和分泌。人胎盘分泌的绒毛膜促性腺激素(hCG)具有FSH和LH的功能，在胎儿垂体分泌LH以前，刺激胎儿睾丸分泌睾酮促进男性性分化；还可促进性腺发育，对男性能刺激睾丸中间质细胞的活力，增加雄性激素(睾酮)的分泌。孕马血清促性腺激素(也叫马绒毛膜促性腺激素)也具有类似FSH和LH的双重活性，在生产上常用以代替较昂贵的FSH而广泛应用于动物的诱发发情、超数排卵或增加排卵率，对雄性动物具有促使精细管发育和性细胞分化的功能。本专利技术采用联合给药的方式，对于雌性幼龄灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1.诱导雌性幼龄灵长类动物：(1)对雌性幼龄灵长类动物每天给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，直到诱导处理结束；(2)当血浆雌激素水平提高5～15倍后，同时给予促卵泡素；(3)在停止使用促卵泡素的当天，同时给予促性腺激素；(4)此后持续给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雌性幼龄灵长类动物卵巢卵泡发育；S2.对步骤S1诱导的雌性幼龄灵长类动物取卵泡液，获得卵母细胞，即为幼龄灵长类动物的雌性配子；S3.诱导雄性幼龄灵长类动物：(1)对雄性幼龄灵长类动物给予促性腺激素，(2)当血浆睾酮水平提高5～15倍或连续给予20～40天后，停止给予促性腺激素，并开始给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雄性幼龄灵长类动物睾丸精子发生；S4.对步骤S3诱导的雄性幼龄灵长类动物获取精液和精子，其精子即为幼龄灵长类动物的雄性配子。

【技术特征摘要】
1.一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1.诱导雌性幼龄灵长类动物：(1)对雌性幼龄灵长类动物每天给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，直到诱导处理结束；(2)当血浆雌激素水平提高5～15倍后，同时给予促卵泡素；(3)在停止使用促卵泡素的当天，同时给予促性腺激素；(4)此后持续给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雌性幼龄灵长类动物卵巢卵泡发育；S2.对步骤S1诱导的雌性幼龄灵长类动物取卵泡液，获得卵母细胞，即为幼龄灵长类动物的雌性配子；S3.诱导雄性幼龄灵长类动物：(1)对雄性幼龄灵长类动物给予促性腺激素，(2)当血浆睾酮水平提高5～15倍或连续给予20～40天后，停止给予促性腺激素，并开始给予促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物，诱导雄性幼龄灵长类动物睾丸精子发生；S4.对步骤S3诱导的雄性幼龄灵长类动物获取精液和精子，其精子即为幼龄灵长类动物的雄性配子。2.根据权利要求1所述的一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法，其特征在于，步骤S1(1)中所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量按幼龄动物的体重计为0.1～50微克/公斤/次，所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予的频率为1～288次/天，连续给予15～60天。3.根据权利要求1所述的一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法，其特征在于，步骤S1(2)中所述促性腺激素释放激素和促卵泡素的同时给予时间为6～12天，所述促卵泡素的每次给予量为5～35IU/公斤，所述促卵泡素的给予频率为1～4次/天；所述促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素类似物的给予量和给予频率与步骤S1(1)中相同。4.根据权利要求1所述的一种诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世华，徐冬冬，黄群山，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44