牛膝粗多糖、多糖组分和均一多糖、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体地，涉及疫苗和免疫领域。具体地，本发明专利技术涉及从牛膝中提取的牛膝粗多糖、牛膝多糖组分以及牛膝均一多糖。其中，所述牛膝粗多糖选自：牛膝粗多糖1：主要由果糖组成；分子量为1000－3000Da；优选地，还含有少量葡萄糖；牛膝粗多糖2：主要由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；分子量为1.0×10

【技术实现步骤摘要】
牛膝粗多糖、多糖组分和均一多糖、其制备方法及其用途
本专利技术属于医药
，具体地，涉及疫苗和免疫领域。具体地，本专利技术涉及从牛膝中提取的粗多糖、多糖组分以及均一多糖。本专利技术还涉及含有它们的药物组合物、其制备方法、以及其用于疫苗佐剂、免疫调节剂或制备疫苗辅料、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
技术介绍
牛膝(AchranthisBidentata和Cyathulaofficinalis)是苋科植物牛膝的干燥根，具有活血、通经、补肝肾、强筋骨之功用。牛膝含有多种次生代谢产物，如齐墩果酸及其皂苷、蒽醌类化合物等，还含有较高含量的多糖[李金亭,等.牛膝类药材的生物学与化学成分的研究进展.中草药，2006，37(6):952-956]。近年来与本专利
相关的研究和报道归纳如下：(1)牛膝多糖制备方法及化学成分的研究许海丹等将牛膝粉末用80％乙醇加热回流，残渣加水煎煮提取,合并滤液、浓缩。浓缩液中加入乙醇至含醇量达到80％。静置12h后分离沉淀，再水溶解，采用Sevage方法去除蛋白。收集清液，再加入4倍乙醇醇析，沉淀部分用乙醚、丙酮反复洗涤，干燥，制备牛膝粗多糖。(许海丹，等.牛膝多糖的提取与含量测定.科学技术与工程，2009，9(1)：107-109.)刘传敏等首先将纤维素酶和牛膝粉末一起加水在恒温摇床上保持一段时间，然后沸水浴煎煮10min，再超声20min，离心，上清合并、浓缩，然后加乙醇至含醇量为80％。静置、离心，沉淀加蒸馏水溶解，三氯乙酸脱蛋白，上清液挥干溶剂，即得牛膝多糖粗品(刘传敏，等.酶解超声法提取川牛膝多糖的正交试验研究.中兽医医药杂志，2009，5：51-53)。魏涛等采用以下工艺制备牛膝粗多糖：怀牛膝→70℃干燥→粉碎过40目筛→石油醚脱脂，体积分数80％乙醇回流→超声波辅助水浸提→离心取上清液→Sevage法除蛋白→浓缩→乙醇沉淀→过滤洗涤→低温干燥→怀牛膝粗多糖(魏涛，等.怀牛膝多糖的超声波辅助提取工艺及其抗氧化性活性.食品与发酵工业，2011，37(2)：191-194)。方积年等将牛膝水煎煮、去除游离蛋白、透析、乙醇醇沉、再水溶解后，依次进行CellexD和SephadexG-150柱层析，得到一个肽多糖ABAB，ABAB分子量为2.3×104，有D-葡萄糖酸、D-半乳糖、D-半乳糖酸、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖组成，摩尔比为12:2:3:1:1。多糖主链结构为(1→4)-D-葡萄糖酸和(1→4)-D-半乳糖酸组成。肽含量为24.7％，主要有甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸和丝氨酸组成(方积年，张志花，刘柏年.牛膝多糖的化学研究.药学学报，1990，25(7)：526-529)。刘颖华等采用水提、醇沉法提取川牛膝粗多糖CPC(无具体操作方法)，CPC再经685弱碱阴离子交换柱层析分离和Bio-GelP2凝胶柱层析纯化，得到川牛膝均一多糖RCP。RCP的分子量(Mr)主要分布在1000-2200，单糖组成为D-果糖和D-葡萄糖(刘颖华，何开泽，张军峰，蒙义文.川牛膝多糖的分离、纯化及单糖组成.应用与环境生物学报，2003，9(2)：141-145)。陈晓明等将牛膝粗多糖AbPS(具体制备方不详)经DEAE-Cellulose和SephadexG-50两次柱色谱纯化得到一小分子量的果聚糖。单糖组成分析表明牛膝多糖由果糖和葡萄糖组成，单糖摩尔比为8：1，其数均分子量为1400u，含有4至21糖。糖链中含有1,2-连接和2,6-连接的果糖残基(陈晓明，等.牛膝多糖的理化性质研究及结构确证.药学学报，2005，40(1):32-35)。Chen等牛膝水煎煮3次，水煎液采用Sevage方法(正丁醇：氯仿＝4:1)脱色素和蛋白后、透析、醇沉(乙醇终浓度80％)。沉淀部分水溶解、H2O2脱色、透析、再醇沉(乙醇终浓度75％)。沉淀部分水溶解部分进行DEAE-纤维素和SephadexG-50柱层析，获得牛膝多糖(ABP)。该ABP有甘露糖和葡萄糖组成，单糖摩尔比为8:1(Chen,etal.Achyranthesbidentatapolysaccharideenhancesimmuneresponseinweanedpiglets.ImmunopharmImmunotoxicol,2009,31(2):253-260)。(2)牛膝粗多糖免疫活性的研究倪青松等采用水煎、醇沉法制备川牛膝粗多糖(具体操作不详)，给7日龄仔鸡饲喂400mg/kg的川牛膝多糖，在14、21和28日龄采颈静脉血，分别检测血清抗体(IgG、IgA、IgM)和血液生化指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、钙、白蛋白)。结果显示：川牛膝多糖400mg/kg剂量组与对照组相比，IgG、IgA和IgM差异均显著(0.01＜P≤0.05)，而白蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、钙的差异均不显著(倪青松，等.川牛膝多糖对鸡血清抗体和血液生化指标的影响.四川畜牧兽医，2011，248：27-28)。王宇学等研究牛膝根多糖ABPS(本院中药研究所，纯度99.9％，理化性质不详)在体外对单核细胞活性的调节及诱导单核细胞HLA-DRA表面分子的表达。结果显示ABPS能诱导单核细胞胞浆溶酶体和胞浆量增多和吞噬能力增强，同时上调单核细胞HLA-DRA表面分子的表达(王宇学，等.牛膝根多糖上调单核细胞免疫功能实验.中国医院药学杂志，2005，25(10)：940-942)。封海波等采用超声辅助下水提、醇沉法(具体方法不详)制备川牛膝粗多糖(RCPS)，硫酸苯酚法-测定其糖含量为78.9％。RCPS和O型口蹄疫灭活疫苗协同免疫ICR小鼠，研究了其对免疫小鼠体内树突状细胞成熟的影响。小鼠在二次免后2周处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液，测定共刺激信号分子(CD40，CD80，CD86)的表达水平，检测了MHCⅠ、MHCⅡ类分子，CXC型趋化因子受体4(CXCR4)和CC趋化因子受体7(CCR7)mRNA表达水平。结果显示：与对照组相比，在二次免疫后14d，RCPS明显增强了共刺激信号分子CD40，CD80，CD86的表达水平，同时提高了MHC-I，MHC-II，CXCR4和CCR7mRNA表达水平(封海波，等.川牛膝多糖对口蹄疫疫苗受免小鼠树突状细胞成熟的影响.中国兽医杂志，2014，50(3)：18-21)。邱妍等采用水煎煮、乙醇沉淀方法提取怀牛膝粗多糖，硫酸-蒽酮法测定其多糖含量为54％(理化性质不详)。14d龄蛋在鸡新支二联弱毒苗点眼滴鼻免疫的同时，分别肌肉注射怀牛膝粗多糖3和6mg/mL二个剂量(每羽注射0.3mL)，每天注射1次，连续注射3次。分别于免疫后第7、14、21、28、35和42天静脉采血，测定新城疫血凝抑制(HI)抗体效价及免疫功能。结果表明怀牛膝多糖高剂量组的HI抗体效价、CD4+/CD8+比值和免疫器官指数都明显高于对照组，并且可以显著促进T淋巴细胞增殖(邱妍，等.怀牛膝多糖对雏鸡疫苗免疫效果的影响.畜牧兽医学报，2007，38(7)：723-727)。牛膝多糖经水煎、醇沉方法提取牛膝粗多糖(具体制备方法不详)，研究对雏鸡进行禽流感灭活苗免疫的影响。肉仔鸡于2和6周龄分别进行禽流感灭活苗本文档来自技高网...

【技术保护点】
牛膝粗多糖，其选自如下的牛膝粗多糖1或者牛膝粗多糖2：牛膝粗多糖1：主要由果糖组成；分子量为1000－3000Da；优选地，还含有少量葡萄糖；优选地，峰高分子量为1900Da；牛膝粗多糖2：主要由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；分子量为1.0×10

【技术特征摘要】
1.牛膝粗多糖，其选自如下的牛膝粗多糖1或者牛膝粗多糖2：牛膝粗多糖1：主要由果糖组成；分子量为1000－3000Da；优选地，还含有少量葡萄糖；优选地，峰高分子量为1900Da；牛膝粗多糖2：主要由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；分子量为1.0×104－2.0×105Da；优选地，峰高分子量为66000Da。2.制备牛膝粗多糖的方法，其选自如下的方法1或者方法2：方法1包括下述步骤：(1)将牛膝药材(例如怀牛膝或川牛膝)用水进行浸泡，保持温度为4－80℃，得到水提液；(2)将水提液进行减压浓缩，浓缩液进行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，得到上清液；(3)取上清液进行水透析或膜过滤；(4)取透析液或滤液进行浓缩，浓缩液进行冷冻干燥，得到牛膝粗多糖1；方法2包括下述步骤：1)将牛膝药材(例如怀牛膝或川牛膝)或者前面步骤(1)中提取后得到的牛膝药材残渣用水进行浸泡或者煎煮，保持温度为81℃－100℃，得到水提液；2)将水提液进行减压浓缩，浓缩液进行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，得到上清液；3)取上清液进行水透析或膜过滤；4)取透析液或滤液进行浓缩，浓缩液进行冷冻干燥，得到牛膝粗多糖2。3.根据权利要求2所述的方法，其中，对于方法1，其特征在于如下的[1]－[13]项中的任意一项或者多项:[1]将所述药材牛膝进行粉碎；[2]步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；[3]步骤(1)中，所述温度为20℃－80℃；优选为25℃－60℃、30℃－55℃、40℃－55℃、45℃－55℃或者48℃－52℃；[4]将步骤(1)中的操作重复一次或者多次，合并水提液；[5]步骤(1)中水的用量为1－50倍量(L/kg)，优选为5－30倍量，优选为50－20倍量或者10－20倍量，例如15倍量；[6]步骤(1)中的浸泡时间为至少1小时、至少2小时、2－24小时、3－12小时或者5小时；[7]步骤(2)中，醇沉后乙醇的终浓度为60％－90％，例如70％－80％；[8]步骤(2)中所用乙醇的量为浓缩液的1－5倍体积，例如3－5倍体积；[9]步骤(2)中醇沉的时间为至少12小时、至少24小时、24－72小时或者48小时；[10]步骤(2)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀用水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液；[11]步骤(2)和/或(4)中减压浓缩的温度为50－55℃；[12]步骤(3)中透析或者膜过滤的截留分子量>1000；[13]步骤(3)中的膜过滤为超滤；其中，对于方法2，其特征在于如下的[1]－[13]项中的任意一项或者多项:[1]将所述药材牛膝或者所述牛膝药材残渣进行粉碎；[2]步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；[3]步骤(1)中，所述温度为82℃－100℃；优选为85℃－100℃、90℃－100℃、95℃－100℃、96℃－100℃、97℃－100℃、98℃－100℃或者99℃－100℃；[4]将步骤(1)中的操作重复一次或者多次，合并水提液；[5]步骤(1)中水的用量为1－50倍量(L/kg)，优选为5－30倍量，优选为50－20倍量或者10－20倍量，例如15倍量；[6]步骤(1)中的浸泡或者煎煮的时间为至少1小时、至少2小时、2－24小时、3－12小时或者5小时；[7]步骤(2)中，醇沉后乙醇的终浓度为60％－90％，例如70％－80％；[8]步骤(2)中所用乙醇的量为浓缩液的1－4倍体积；[9]步骤(2)中醇沉的时间为至少12小时、至少24小时、24－72小时或者48小时；[10]步骤(2)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀用水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液；[11]步骤(2)和/或(4)中减压浓缩的温度为50℃－55℃；[12]步骤(3)中透析或者膜过滤的截留分子量>1000；[13]步骤(3)中的膜过滤为超滤。4.一种牛膝粗多糖，其由权利要求2或3所述的方法制得。5.牛膝多糖组分，其选自如下的牛膝多糖组分1－5：牛膝多糖组分1：主要由果糖组成；含有或者为一个均一多糖，分子量为1900±1000Da；优选地，还含有少量葡萄糖；优选地，峰高分子量为1860Da；牛膝多糖组分2：主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成；含有峰高分子量大于200,000Da的多糖I、分子量为48,300±25,000Da的多糖II以及寡糖；优选地，多糖II的峰高分子量为48,300；牛膝多糖组分3：主要由阿拉伯和葡萄糖组成；含有分子量为3300±2000Da的多糖；优选地，多糖的峰高分子量为3300Da；牛膝多糖组分4：主要由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；含有二个多糖，分子量分别为55,000±30,000Da、7300±4000Da；优选地，多糖的峰高分子量分别为55,000Da和7300Da；牛膝多糖组分5：主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；为不对称糖分布，主要峰的分子量为97,100±40,000Da；优选地，主要峰的峰高分子量为97,100Da。6.制备牛膝多糖组分的方法，其选自如下的方法A或者方法B：方法A包括下述步骤：将权利要求1或4所述的牛膝粗多糖1用水溶解后，通过选自DEAE-纤维素柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、琼脂糖凝胶柱层析和丙烯葡聚糖凝胶柱层析中的至少一种进行分离，采用水或盐洗脱，得到牛膝多糖组分1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：单俊杰，王玉霞，汪艳艳，麻浩，李帅，李海霞，巫亚俊，武军华，刘坤璐，陈志宏，刘圆圆，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11