一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种双重功效融合蛋白（Tɑ1‑Fc）及其抗肿瘤及免疫活性。将IgG1Fc基因与人Tɑ1基因融合在一起，构建含有Tɑ1‑Fc基因的大肠杆菌（E.coli）基因工程菌，制备获得Tɑ1‑Fc融合蛋白。本发明专利技术所述的融合蛋白既具有胸腺肽ɑ1的效应功能又具有抗体的一系列功能，可以达到高效且副作用低的治疗肿瘤的目的。本发明专利技术适用于预防和治疗各种腺癌及其转移癌以及治疗免疫缺陷，可与抗病毒药物、促细胞生长素联合用药或者与化疗药物配伍使用。

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白
本专利技术涉及肿瘤生物治疗中主动特异性免疫技术，尤其是提供了一种重组人Tɑ1-Fc融合蛋白抗肿瘤药物及制备工艺，以达到预防和治疗肿瘤的目的，属于生物工程

技术介绍
胸腺肽ɑ1由28个氨基酸组成，主要分布在胸腺组织，尤其是胸腺上皮细胞中，另外，也存在于淋巴组织(如脾、淋巴结)和非淋巴组织(如肺、肾和脑)中，其分泌和释放并不受其他激素或者释放因子所调节。胸腺肽ɑ1可以增强Tregs、IL-1β、TNF-ɑ和IL-6等免疫作用，调节机体免疫功能，降低促炎症因子水平，减轻炎症介质作用，抗肿瘤作用，对其他疾病也有显著的治疗效果。但胸腺肽ɑ1在体内易被降解失活，体内半衰期很短(<2h)。Fc是抗体经木瓜蛋白酶/胃蛋白酶水解后的一个片段。据报道Fc片段能显著性提高与之结合的生物活性蛋白的半衰期。Fc融合蛋白赋予所融合功能蛋白类似抗体的特性，包括延长其血浆半衰期以及Fc片段特有的一系列特有的效应功能，可广泛应用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及蛋白分析定量等生物医学研究中。
技术实现思路
：本专利技术利用基因工程的方法，提供一种重组人Tɑ1-Fc融合蛋白、制备方法及用途。本专利技术所述Tɑ1-Fc融合蛋白能够用于肿瘤生物治疗中特异性免疫，达到高效且副作用低的治疗肿瘤的目的。本专利技术将IgG1Fc基因与人Tɑ1基因融合在一起，导入原核表达载体，在大肠杆菌中直接高效诱导表达Tɑ1-Fc融合蛋白。得到的Tɑ1-Fc融合蛋白既具有胸腺肽ɑ1的效应功能又具有抗体的一系列功能。本专利技术的具体技术方案如下：一种双重功效融合蛋白，由胸腺肽α1通过连接肽或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的另一目的在于提供本专利技术所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)设计合成并克隆得到本专利技术所述融合蛋白的编码基因；(2)构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行表达；(3)收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到。本专利技术一个具体的方案如下，(1)将将Fc基因连在Tɑ1基因之后，构建原核表达载体pET-32a，通过酶切鉴定重组载体的正确性。(2)表达Tɑ1-Fc融合蛋白的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在乳糖的诱导下，表达融合蛋白Tɑ1-Fc，通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定其正确性。(3)常规基因测序测定Tɑ1-Fc融合蛋白的基因序列。(4)大量培养重组大肠杆菌，经超声破碎提取全菌上清液，通过HisTrapTM-HP柱/ProteinA柱→HisTrapTMDesalting柱获得较纯的Tɑ1-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE得到鉴定。对本专利技术所述融合蛋白Tɑ1-Fc抗肿瘤及免疫活性进行了测定，包括：(1)Tɑ1-Fc抗鼠乳腺癌活性：将鼠乳腺癌细胞4T1皮下注射到Balb/c小鼠体内，10天后给药并测量肿瘤体积。持续3周左右。(2)Tɑ1-Fc抗人乳腺癌活性：将人乳腺癌细胞MCF-7皮下注射到裸鼠体内，10天后给药并测量肿瘤体积。持续4周左右。(3)Tɑ1-Fc免疫增强活性：将40mg/kg氢化可的松(HC)皮下注射到六周龄雄性ICR小鼠体内，持续7天左右，构建小鼠免疫抑制模型，给药7天，测脾和胸腺指数及血清中细胞因子含量。实验结果表明本专利技术所述融合蛋白Tɑ1-Fc相较于胸腺肽ɑ1具有优越的抗肿瘤和免疫增强活性。本专利技术的另一目的在于提供本专利技术所述融合蛋白在制备治疗原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病及癌症药物中的应用。所述原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病包括重症肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎及肝硬化、带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣、支气管炎、支气管哮喘、肺结核、上呼吸道感染、红斑狼疮、风湿性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综合症、再生障碍性贫血、白血病、血小板减少症、病毒性角膜炎、病毒性结膜炎、过敏性鼻炎、老年性早衰、妇女更年期综合症、多发性疖肿及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症、儿童先天性免疫缺陷症等。所述癌症优选为各种腺癌及其转移癌。本专利技术的另一目的在于提供包括本专利技术所述融合蛋白及药学上可接受的载体的药物组合物。进一步的，所述药物组合物还包括抗病毒药物、促细胞生长素或化疗药物。本专利技术适用于下述医疗用途：1.预防和治疗各种腺癌及其转移癌。2.治疗免疫缺陷。3.与抗病毒药物联合用药。4.与促细胞生长素联合用药。5.与化疗药物配伍使用。本专利技术优点：目前肿瘤治疗采取综合疗法包括手术、放疗和化疗。癌症患者在接受手术或放化疗后免疫系统会受到不同程度的的损伤。胸腺肽ɑ1是从胸腺中获得的重要免疫增强剂，已成功用于临床肿瘤辅助治疗，可以降低血液及神经毒性，有助于免疫抑制的逆转，推迟复发时间和延长存活时间。但胸腺肽ɑ1在体内易被降解失活，体内半衰期很短(<2h)。本专利技术利用Fc片段赋予所融合功能蛋白类似抗体的特性，得到的融合蛋白Tɑ1-Fc相较于胸腺肽ɑ1具有更优越的抗肿瘤和免疫增强活性。可广泛应用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及蛋白分析定量等生物医学研究中。附图说明图1是Tɑ1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE图及Westernblot鉴定。(图1-1M表示蛋白Mark；1表示未加入诱导剂时菌体破碎上清；2表示加入诱导剂后菌体破碎上清；箭头指示目的蛋白位置；图1-2B为是融合蛋白SDS-PAGE图片，1-2A是检测融合蛋白Tɑ1部分，1-2C是检测融合蛋白IgG1FC片段)。图2是Tɑ1-Fc融合蛋白的纯化图(M表示蛋白Mark；1是未加入诱导剂时菌体破碎上清；2是加入5mM乳糖时菌体破碎液上清；3-4是100mM咪唑洗脱液；5是200mM咪唑洗脱液)。图3是Tɑ1-Fc融合蛋白对小鼠乳腺癌4T1模型的抗肿瘤活性(图3-1是小鼠乳腺癌4T1模型中不同组的肿瘤重量，图3-2是不同时间肿瘤体积的变化)。图4是Tɑ1-Fc融合蛋白对人乳腺癌MCF-7模型的抗肿瘤活性(图4-1是人乳腺癌MCF-7模型中不同组的肿瘤重量，图4-2是不同时间肿瘤体积的变化)。具体实施方式实施例一Tɑ1-Fc融合蛋白重组载体的表达与鉴定1.重组基因的诱导表达将融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的序列转换成所对应的核苷酸序列其互补序列进行基因合成，合成的序列两端设计了NcoI和HindIII酶切位点，将合成的基因与原核表达载体pET-32a进行连接，再将正确连接的pET-32a-Tɑ1-Fc质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并将其涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板中，37℃过夜培养；从LB固体平板中挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；将250μL的过夜培养物接种于25mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床37℃200rpm培养3个小时，至菌达到其对数生长期，加入5mM乳糖诱导4个小时，离心沉淀细菌，弃上清，沉淀保存于-20℃；重悬沉淀，然后加入10倍菌体湿重的菌悬液重悬菌体，将菌体重悬液与上样缓冲液按同体积混合，80-100℃高温变性5分钟，离心，取上清10-15μL加入到SDS-PAGE上电泳鉴定蛋白的表达情况。由图1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双重功效融合蛋白，其特征在于由胸腺肽α1通过连接肽或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种双重功效融合蛋白，其特征在于由胸腺肽α1通过连接肽或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计合成并克隆得到如权利要求1所述融合蛋白的编码基因；(2)构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行表达；(3)收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到。3.如权利要求1所述融合蛋白在制备治疗原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病及癌症药物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病包括重症肝炎、慢性活...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳兴珍，王凡文，吴扬生，郑珩，李晴晴，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32