熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，包括：1)、将熊蜂PGRP‑SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。本发明专利技术对熊蜂PGRP‑SA蛋白表达条件进行了优化，优选了各过程中重要试剂的配方，结合采用层析法复性，方法简单快速，操作过程温和，对蛋白损伤小，获得了高纯度的活性蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法。
技术介绍
昆虫作为地球上种类最多的动物，目前已知的约有100万种，它们大多生活在充满病原微生物的恶劣环境中，在长期的进化选择压力下昆虫形成了一套独特的免疫防御体系来对抗这些病原微生物的入侵。昆虫缺乏获得性免疫，仅依靠先天免疫作为其防御机制。对于外来入侵的病原微生物来说，昆虫通过先天免疫进行抵抗，第一步是通过模式识别受体识别病原相关分子模式，从而激活下游反应。在昆虫中作为模式识别受体的有：肽聚糖识别蛋白(PeptidoglycanRecognitionProteins，PGRPs)、β-葡聚糖识别蛋白(β－GlucanRecognitionProteins，β－GRP)以及革兰氏阴性菌结合蛋白(Gram－neg－ativeBindingProtein，GNBP)，但其中最主要的模式识别受体是肽聚糖识别蛋白。PGRPs最初于家蚕的血淋巴中被发现，此蛋白结合细菌肽聚糖并激活酚氧化酶原级联反应-昆虫宿主抗菌防御机制。PGRP-SA为分泌型PGRPs，识别革兰氏阳性菌或真菌细胞壁肽聚糖(PGN)活化Toll信号通路诱导抗菌肽的表达，抵御细菌与真菌等病原微生物的入侵。熊蜂基因组测序揭示了熊蜂拥有4个PGRPs蛋白，在细菌感染刺激后其PGRP-SA蛋白的表达量显著上调。果蝇、小菜蛾与家蝇等昆虫的肽聚糖识别蛋白PGRP-SA已分别于昆虫Hi-5细胞、果蝇S2细胞、大肠杆菌(PET28a+载体)进行了表达；小菜蛾PGRP-SA蛋白的专利已申请专利并授权(公开号CN103484468A，公开日2014年1月1日)；上述昆虫PGRP-SA的研究中仅有果蝇PGRP-SA表达后，经纯化后，蛋白纯度达到90％以上。然而上述研究并没有形成昆虫的PGRP-SA蛋白规模化制备以及高纯度蛋白纯化的有效方法。熊蜂是众多野生植物与农作物的有效授粉昆虫，具有重要的经济价值与生态价值；同时，熊蜂的健康受到细菌等多种病原微生物的威胁，其先天免疫系统中重要免疫分子肽聚糖识别蛋白PGRP-SA的体外制备尚未见有报道，这严重阻碍了熊蜂新型抗菌免疫药物的研究与应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，该方法能够高效制备并复性获得高纯度、高均一性的活性目标蛋白。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。在蛋白质的表达纯化过程中，复性问题一直是生物工程中的一个难点和热点。其关键问题来自于复性过程中聚集体的形成。当蛋白在高浓度下折叠复性时，伸展的肽链由于疏水基团的外露，更加容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。经典的复性方法一般采用稀释法和透析法，前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求很低的蛋白浓度；而后者操作繁琐，不利于放大。超滤法复性可以将变性剂用复性缓冲液连续置换，使变性剂浓度缓慢降低，而蛋白浓度不会明显降低，而且便于自动化操作，但剪切力可能导致复性好的蛋白质重新变性而降低活性收率。其它改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性，它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。本专利技术采用的层析法复性是近年来基于层析分离原理的基础上发展起来的一种新的复性方法。这种方法对蛋白比较温和，处理的蛋白浓度可以很高，操作简单、周期短，被广泛用于进行蛋白质复性，因此逐渐发展成一种将纯化和复性结合起来的复合式纯化方法。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：对熊蜂PGRP-SA蛋白表达条件进行了优化，优选了各过程中重要试剂的配方，结合采用层析法复性，方法简单快速，操作过程温和，对蛋白损伤小，获得了高纯度的活性蛋白质。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为熊蜂PGRP-SA(bPGRP-SA)诱导表达后收集的包涵体蛋白电泳图；图2为熊蜂PGRP-SA(bPGRP-SA)包涵体经过洗涤液洗涤后的包涵体蛋白电泳图；图3为熊蜂PGRP-SA(bPGRP-SA)Superdex200Increase纯化图；图4为熊蜂PGRP-SA(bPGRP-SA)ResourceQ纯化图；图5为熊蜂PGRP-SA(bPGRP-SA)纯化后SDS-PAGE鉴定图。具体实施方式本专利技术涉及一种肽聚糖识别蛋白PGRP-SA的体外表达、折叠复性以及多步骤纯化方法的建立；特别是涉及野生植物与农作物重要授粉昆虫-熊蜂先天抗菌免疫反应中重要识别分子PGRP-SA蛋白的体外制备方法。一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。优选的，如上所述的制备方法，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段如SEQIDNO:1所示。在蛋白表达时，所选取的片段的大小及带电荷情况对表达效率有着很大的影响。优选的，如上所述的制备方法，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段的获取方法为：以熊蜂cDNA为模板，以SEQIDNO:2所示的上游引物和SEQIDNO:3所示的下游引物进行扩增；优选的，退火温度为57℃～59℃，循环次数为28～32次；在一些实施方式中，扩增时采用Takara公司LATaq酶进行扩增；在一些实施方式中，扩增时PCR反应的条件为：①92℃～95℃变性3～8min；②92℃～95℃变性25～35s；③57℃～59℃退火0.5～2min；④70℃～73℃延伸20～40s；重复②～④28～32次；⑤70℃～73℃延伸7～12min；可选的，⑥0～6℃持续保温。更优选的，在一些实施方式中，扩增时PCR反应的条件为：①93℃～95℃变性3～6min；②93℃～95℃变性27～32s；③57℃～59℃退火1～1.5min；④71℃～73℃延伸25～35s；重复②～④29～31次；⑤71℃～73℃延伸8～11min；可选的，⑥2～6℃持续保温。优选的，如上所述的制备方法，所述表达载体为PET21a+载体。优选的，如上所述的制备方法，在步骤2)中，洗涤所述包涵体蛋白时所用的洗涤液选自洗涤液A和/或洗涤液B；所述洗涤液A的成分包括0.4％～0.6％(v/v)Triton-100，45～55mMTris-Cl，280～320mMNaCl，8～12mMEDTA-Na2，8～12mMDTT，pH＝7.8～8.2；所述洗涤液B的成分包括45～55mMTris-Cl，80～120mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP‑SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。

【技术特征摘要】
1.一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段的获取方法为：以熊蜂cDNA为模板，以SEQIDNO:2所示的上游引物和SEQIDNO:3所示的下游引物进行扩增；优选的，退火温度为57℃～59℃，循环次数为28～32次。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为PET21a+载体。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，洗涤所述包涵体蛋白时所用的洗涤液选自洗涤液A和/或洗涤液B；所述洗涤液A的成分包括0.4％～0.6％(v/v)Triton-100，45～55mMTris-Cl，280～320mMNaCl，8～12mMEDTA-Na2，8～12mMDTT，pH＝7.8～8.2；所述洗涤液B的成分包括45～55mMTris-Cl，80～120mMNaCl，8～12mMEDTA-Na2，8～12mMDTT，pH＝7.8～8.2；优选的，用洗涤液A洗涤1～3次后再用洗涤液B洗涤1～2次。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白变性剂中包含5～7mol的盐酸胍；优选的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彦杰，安建东，黄家兴，孙成，丁桂玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11