用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，具体公开了一种用于剔除标记基因的CPP5‑Cre融合蛋白及其应用，所述CPP5‑Cre融合蛋白包括短的5氨基酸细胞穿膜肽CPP5（KLPVM）和位点特异重组酶Cre蛋白。利用表达纯化后的CPP5‑Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞孵育后，获得筛选标记基因剔除的阳性克隆后进行体细胞克隆，获得F0代的筛选标记基因剔除的转基因猪。

【技术实现步骤摘要】
用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程，具体地说，涉及一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。
技术介绍
动物转基因技术是在经典遗传学、分子遗传学和DNA重组技术的基础上，运用基因工程等技术手段，将感兴趣的外源目的基因或重组基因稳定整合于宿主动物的染色体基因组并稳定遗传给后代的一种新兴生物技术。最早于1976年由Jaenisch首先利用逆转录病毒感染小鼠早期胚胎首次得到莫氏白血病病毒转基因小鼠。随着新技术新方法的出现，动物转基因技术也在不断的完善之中。利用传统的转基因方法，如显微注射法、精子载体法、电穿孔法、体细胞克隆法等，已经制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛、羊、鸡等多种转基因动物。而且由于猪于人类具有大量相似的解剖、生理、代谢、病理。例如，他们有一个非常相似的胃肠道解剖和功能、胰腺形态和代谢调节。因此猪比小鼠更适合用于人类疾病模型研究，同时猪肉又是人类主要的营养来源。伴随着ZNF/TALEN/Cas9等最新技术的出现，使得转基因大动物具有更加广阔的应用前景，如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等,将给人类带来巨大的经济效益。在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90%，这意味着作为动物农业整个产业链源头的畜牧类品种，严重依赖于国际市场。因此转基因技术提高迫切需要。目前最大限制转基因技术发展的障碍是筛选标记基因的存在。因为在转基因过程中，除了表达目的基因外，还需要筛选标记基因。标记基因即选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。由于转基因效率低，因此必须利用标记基因对阳性克隆进行筛选和富集。但标记基因的存在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响，同时还将带来严重的安全性问题。目前虽然有一些技术可以去除筛选标记基因，但是这些方法主要用于小鼠，而且有很大缺陷。例如通过瞬时表达Cre重组酶载体，需要额外的细胞转染过程，而且存在整合隐患和细胞毒性。在大动物的研究很少，2009年，本课题组利用体外转录mRNA瞬时表达Cre酶，获得标记基因敲除的转基因牛。目前为止，还没有对猪进行筛选标记基因即（markerfree）的相关研究。因此建立简便、高效、快速标记基因敲除的转基因猪技术研究显得尤为重要。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种用于剔除标记基因的CPP5-Cre融合蛋白，所述融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了一种表达前述CPP5-Cre融合蛋白的载体。本专利技术还提供了一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，所述方法包括以下步骤：1）构建CPP5-Cre原核表达载体；2）利用步骤1）表达载体进行CPP5-Cre融合蛋白的表达及纯化；3）将步骤2）得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪体细胞共培养；4）鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；5）通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体。进一步地，所述步骤1）将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker；用NcoI+NdeI酶双切pET28.2-Cre，回收得到目的片段与linker连接，转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体；所述pCPP5-CRE载体的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。进一步地，所述步骤3）将步骤2）得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞，进行孵育共培养获得克隆。进一步地，所述步骤5）将步骤4）筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得F0代筛选标记基因剔除的转基因阳性猪。本专利技术进一步提供了前述CPP5-Cre融合蛋白和表达该融合蛋白的载体在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了简便、高效、快速的去除转基因猪筛选标记基因方法即markerfree。其原理是利用短的5氨基酸的细胞穿膜肽和位点特异重组酶Cre/loxP系统构建融合的蛋白使其具有穿膜、入核、剪切markergene的功能。而且只要将纯化出的蛋白与带有markergene的猪成纤维细胞孵育3h后，共培养获得克隆，然后进行PCR鉴定，将阳性克隆用于后期核移植，即可在F0代获得markerfree的转基因猪。本专利技术解决了猪标记基因敲除的技术问题，对于大动物转基因未来的应用及其基础研究打下重要的基础。附图说明图1为本专利技术含有短细胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表达载体图；图2为本专利技术CPP5-Cre蛋白纯化图；图3为本专利技术蛋白处理后获得阳性克隆PCR鉴定结果；图4为本专利技术markerfree阳性F0代猪PCR检测结果；具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中载体设计由本课题组完成，序列测定由北京华大基因完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自北京NEB公司，体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、原核表达及其纯化等常规实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。实施例1含有短细胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表达载体图将5氨基酸短肽CPP5构建到pET28.2-Cre原核表达载体（addegene公司提供）中。首先通过生工公司合成1对引物，引物中含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点：Up:catgggcAAACTGCCGGTTATGggcca；Down:tatggccCATAACCGGCAGTTTgcc。然后通过体外做成linker，50体系：引物各22.5μl、5μl的10xbufferPCR。99度变性5分钟室温复性10分钟，4度保存用于后面实验。用NcoI+NdeI酶双切pET28.2-Cre，体系为50μl：载体2μl、酶各2μl、10xbuffer4加5μl、无菌水31μl，37度酶切2h，跑胶回收得到6319bp的目的片段；将上述回收的片段和linker连接，体系10μl：回收片段7μl、大linker1μl、10xbuffer加1μl、T4连接酶1μl，16度过夜连接。转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体（核苷酸序列如SEQIDNo.3所示），备用。实施例2CPP5-Cre蛋白纯化图1.CPP5-Cre的原核表达1）将含有表达载体的BL21菌接种到5ml的培养基中，37℃过夜培养；2）1:100转接至500ml的培养基中，37℃培养2.5h；3）加入IPTG至终浓度0.2mM，16℃诱导16h。2.Ni-Nta柱纯化1）集菌，加入培养基体积1/10的solutionA，重悬并超声破碎细胞；2）13000g离心10min，上清液用0.45μm的滤膜过滤；3）Ni柱用5倍体积的milliQ水洗涤，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)构建CPP5‑Cre原核表达载体；2)利用步骤1)表达载体进行CPP5‑Cre融合蛋白的表达及纯化；3)将步骤2)得到的CPP5‑Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞进行孵育共培养获得克隆；4)鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；5)通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体；所述CPP5‑Cre融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)构建CPP5-Cre原核表达载体；2)利用步骤1)表达载体进行CPP5-Cre融合蛋白的表达及纯化；3)将步骤2)得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞进行孵育共培养获得克隆；4)鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；5)通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体；所述CPP5-Cre融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker；用NcoI+NdeI酶双切pET-28.2CRE，回收得到目的片段与li...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，孙照霖，康倩倩，李秋艳，赵蕊，孙永川，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11