可溶性 PD‑1变体、融合构建体及其用途制造技术

提供了可溶性PD‑1(sPD‑1)蛋白、所述包含所述sPD‑1蛋白的融合蛋白、编码所述sPD‑1蛋白和融合蛋白的核酸。所述sPD‑1蛋白具有如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。还提供了包含所述sPD‑1蛋白、融合蛋白或核酸的药物组合物，特别是疫苗组合物。本发明专利技术的sPD‑1蛋白、融合蛋白、核酸和治疗组合物可以提供免于病原体感染包括HIV感染的保护性免疫，并且可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。

Soluble PD variants, 1 fusion constructs and its use

Provides 1 soluble PD (sPD 1) protein, the nucleic acid containing the fusion protein, encoding the sPD protein of the sPD 1 1 protein and fusion protein. The sPD 1 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO:11, SEQ ID and SEQ NO:15 ID is shown in NO:25. The fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, SEQ NO:17, SEQ ID ID NO:19, SEQ ID and SEQ NO:23 ID is shown in NO:27. Contains the sPD 1 drug combination protein, fusion protein or nucleic acid is also provided, especially the vaccine composition. The invention of the sPD 1 protein, fusion protein, nucleic acid and therapeutic compositions can provide protective immunity against pathogens infection including HIV infection, and can be used for the prevention and / or treatment of tumors or cancer.

【技术实现步骤摘要】
可溶性PD-1变体、融合构建体及其用途本申请是分案申请，其母案的中国申请号是：201180054073.3，国际申请号是PCT/CN2011/082087，申请日是2011年11月11日。说明书交叉引用相关申请本申请要求2010年11月11日提交的美国临时申请序列号61/412,557的权益，所述申请完整地通过引用并入本文。
技术介绍
主要在T细胞上表达的编程性死亡1(PD-1)是B7-H1分子(也称为编程性死亡配体1(PD-Ll))和B7-DC分子(也称为编程性死亡配体2(PD-L2))的受体。PD-L1在许多不同细胞类型上表达，而PD-L2仅在抗原递呈细胞如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞上表达。将阴性信号传递至免疫细胞的PD-l/PD-L通路在感染和癌症期间的免疫应答调节中发挥关键作用。PD-1与PD-L1/L2的相互作用在HIV感染期间抑制T细胞功能。最近的研究表明在慢性猴免疫缺陷病毒(SIV)感染期间抗PD-1抗体对PD-1的阻断导致增强的B细胞应答以及SlV特异性多功能CD8T细胞的快速增殖和恢复。其他研究表明PD-l/PD-L通路的阻断促进LCMV和HBV感染期间的体液和细胞介导的免疫应答的恢复。人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)自从其在1981年首次认识到以来已经导致了估计2500万人死亡。目前，全世界有超过3300万人具有该病毒生活。通过将HIV-1p24与DEC-205抗体融合而获得的一种现有的HIV疫苗组合物增强了CD4T细胞免疫应答和细胞因子释放。此外，该疫苗组合物赋予了免于牛痘-gag病毒攻击的保护。然而，该HIV疫苗组合物没有改善Th1CD8T细胞应答。因此，需要增强免于HIV感染的宿主免疫和保护的改进的HIV1疫苗组合物。如从下列公开内容清楚地看到的，本专利技术提供了这些和其他益处。
技术实现思路
本专利技术提供了可溶性PD-1(sPD-1)蛋白和核酸，和包含sPD-1蛋白和核酸的治疗组合物，其用于增强受试者的免疫力。在一个实施方案中，将sPD-1蛋白、核酸、和组合物配制为疫苗组合物。本专利技术的一个方面提供了sPD-1蛋白变体。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-14del，其具有包含SEQIDNO:11的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-322mu，其具有包含SEQIDNO:15的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是hspd1-14del，其存在于健康中国人中。hspd1-14del变体具有包含SEQIDNO:25的氨基酸序列。本专利技术的另一个方面提供了编码本专利技术的sPD-1蛋白的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子编码mspd1-14del，并且具有包含SEQIDNO:12的序列。在一个实施方案中，核酸分子编码mspd1-322mu，并且具有包含SEQIDNO:16的序列。在一个实施方案中，核酸分子编码hspd1-14del，并且具有包含SEQIDNO:26的序列。此外，本专利技术提供了sPD-1融合蛋白。在特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包括SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23或SEQIDNO:27。本专利技术还提供了sPD-1融合核酸分子。在特定实施方案中，本sPD-1融合DNA包括SEQIDNO:14、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:24或SEQIDNO:28。本专利技术的另一个方面提供了用于预防和/或治疗病原体感染、癌症或肿瘤和其中诱导抗原特异性保护性免疫将是有益的其他疾病的方法。有利地，本专利技术的方法增强宿主体液和细胞介导的免疫。该方法包括将有效量的本专利技术的融合蛋白或融合核酸分子施用于需要这样的治疗的受试者。在优选实施方案中，本方法可以用于预防和治疗HIV或其他病原体感染。此外，该方法可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。本专利技术进一步提供了治疗或药物组合物。在一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的本专利技术的蛋白和/或核酸分子和任选的药学上可接受的载体。在优选实施方案中，治疗组合物是疫苗组合物。附图说明图1A显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列的比对。图1B显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc的Western印迹分析。通过抗兔Fc抗体检测蛋白。图2显示msPD1-p24-Fc融合蛋白与sPD-1配体的结合能力。(A)显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc分别与小鼠PD-L1的结合能力。(B)显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc分别与小鼠PD-L2的结合能力。图3显示野生型sPD1DNA引发针对HIVp24的体液和细胞介导的免疫应答。(A)显示在分别用p24-Fc、mspd1-p24-Fc和mspd1-IgVΔ-p24-Fc融合DNA免疫的小鼠中抗p24IgG1和IgG2a抗体的血清水平。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(B)显示关于CD8T细胞对于p24表位gagAI(AMQMLKDTI)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(C)显示免疫小鼠的分离的脾细胞的图像。为了分析p24-特异性免疫应答，用H2d-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色脾细胞用于CD8T细胞群体分析。(D)显示关于CD4T细胞对于p24表位gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。数据代表在相同批次的免疫小鼠上的三次实验。图4显示用野生型msPDl融合DNA免疫保护免于病毒感染。最后免疫后三周用4×107PFU的牛痘VTT-HIV-gagpol鼻内攻击用p24-Fc、mspd1-p24-Fc或mspd1-IgVΔ-p24-Fc免疫的Balb/c小鼠。病毒攻击后3天将小鼠处死。通过在Vero细胞中的噬斑形成测定评价肺中的病毒滴度。条代表五份样品的平均值(±标准偏差)。图5显示，使用sPD-1-p24-fc靶向DC诱导了增强的p24特异性抗体和T细胞应答。(A)通过使用抗小鼠PD-L1或L2抗体的流式细胞术分析验证了在从Balb/c小鼠分离的纯化的CD11c+BM-DC上PD-L1和PD-L2的表达(实线，无阴影)。用同种型抗体对照染色的细胞显示为阴影图。(B)用纯化的msPD-1-p24-fc和msPD1-IgVΔ-p24-fc蛋白处理的BM-DC以检查结合。通过使用抗兔Fc-FITC的流式细胞术检测与DC结合的蛋白(实线，无阴影)，平行的是作为阴性对照的没有蛋白处理的DC(阴影)。通过尾静脉注射将20µgmsPD-1-p24-fc或msPD1-IgVΔ-p24-fc蛋白处理的2×106DC引入Balb/c小鼠，每三周一次，持续共六周的实验持续时间。接受未处理的CD11c+DC的小鼠充当对照。(C)收集小鼠血清，并且通过ELISA分析针对HIV-1p24特异性的IgG1和IgG2a抗体的存在。(D)在分别使用特异性肽gagAI和gag26刺激的小鼠脾细胞中通过ELISpo本文档来自技高网...

【技术保护点】
可溶性PD‑1蛋白，其由选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
2010.11.11 US 61/4125571.可溶性PD-1蛋白，其由选自SEQIDNO:21的氨基酸序列组成。2.PD-1核酸分子，其编码权利要求1中的可溶性PD-1蛋白。3.可溶性PD-1融合蛋白，其包含可溶性PD-1蛋白部分和靶蛋白部分，其中所述可溶性PD-1蛋白部分由SEQIDNO:21的氨基酸序列组成。4.权利要求3中的可溶性PD-1融合蛋白，其中所述靶蛋白部分来自病毒、细菌或真菌病原体，和肿瘤细胞的蛋白片段。5.权利要求4中的PD-1融合蛋白，所述病原体选自人免疫缺陷病毒、人类单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型、流感病毒、牛白血病病毒、EB病毒、百日咳杆菌、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、炭疽杆菌、破伤风杆菌、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、白喉杆菌、乳头瘤病毒、肺炎球菌、斑疹伤寒立克次体、伤寒杆菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、螺旋体、霍乱杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风杆菌、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、黄病毒、登革热病毒、弓形体、球孢子菌、血吸虫、结核分枝杆菌、或疟原虫。6.权利要求4中的PD-1融合蛋白，所述靶蛋白部分来自HIVp24。7.权利要求3中的PD-1融合蛋白，其进一步包含Fc结构域。8.权利要求7中的PD-1融合蛋白，其进一步包含接头序列，其中所述接头序列连接所述可溶性PD-1结构域和所述蛋白。9.权利要求3中的PD-1融合蛋白，其由SEQIDNO:23的氨基酸序列组成。10.PD-1融合核酸分子，其编码权利要求3-9中任一项的PD-1融合蛋白。11.权利要求10中的PD-1融合核酸分子，其中所述核酸分子为SEQIDNO:24的序列。12.疫苗组合物，其包含权利要求10或11中的PD-1融合核酸分子。13.权利要求10的融合核酸在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗需要这样的预防或治疗的受试者中的病原性感染和/或肿瘤或癌症。14.权利要求13的用途，其中所述病原性感染由病原体引起，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志伟，周京颖，
申请(专利权)人：港大科桥有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港,81