痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法技术

本发明专利技术提供了一种痰液中醋酸镰孢氨酸C(TAFC)和双甲硫基胶霉毒素(bmGT)的高效液相色谱‑串联质谱同时检测方法，步骤如下：(1)标样和试样的制备；(2)采用液相色谱‑串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中TAFC、bmGT和非那西丁的峰面积；(3)绘制TAFC和bmGT的工作曲线，根据试样谱图中TAFC与非那西丁的峰面积比值、bmGT与非那西丁的峰面积比值和工作曲线计算出试样中TAFC和bmGT的浓度。本发明专利技术实现了从痰液中对TAFC和bmGT的同时检测，为TAFC和bmGT的检测提供了新的途径，有利于提高检测效率。

At the same time detection method of high performance liquid acetic acid fusarinine C in sputum and double methylthio gliotoxin chromatography tandem mass spectrometry

The invention provides a sputum acetate in fusarinine C (TAFC) and double methylthio gliotoxin (bmGT) and detection method of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry steps are as follows: (1) standard sample and sample preparation; (2) by liquid chromatography tandem mass spectrometry method of step (1) from the standard samples and the samples were determined by standard sample and record the spectrum of sample, standard sample and spectrum of sample TAFC, bmGT and phenacetin peak area; (3) the working curve drawing TAFC and bmGT, according to the spectrum of sample TAFC and the cefoxitin peak area ratio and bmGT and non peak area ratio and the working curve of phenacetin calculate the concentration of TAFC and bmGT in the sample. The invention realizes simultaneous detection of TAFC and bmGT from sputum, and provides a new approach for detecting TAFC and bmGT, and is beneficial for improving detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法
本专利技术属于仪器分析检测领域，涉及一种痰液中醋酸镰孢氨酸C(N,N',N"-triacetylfusarinineC,TAFC)和双甲硫基胶霉毒素(bis(methylthio)gliotoxin,bmGT)的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法。
技术介绍
曲霉菌是自然界中广泛存在的一种真菌，在相对温暖和湿润的环境中会较为快速的生长和繁殖。空气中弥散的真菌孢子可通过人体的呼吸进入呼吸道定植。为了深入了解曲霉菌在人群中的分布情况，国内、外研究者在不断探索呼吸道中是否有曲霉菌定植的方法。目前鉴定人体呼吸道内是否有曲霉菌定植的方法主要是痰液真菌培养，然而该方法敏感性很低而且培养周期很长。因此，目前有越来越多的研究在探索通过曲霉菌标志物的检测来判断呼吸道是否存在曲霉菌定植。TAFC是曲霉菌在缺铁环境下合成和释放的一种铁载体。bmGT是由曲霉菌合成和分泌的另一种化合物。目前，有文献报道使用高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)从血清中检测TAFC的方法，也有研究者采用高效薄层色谱分析仪(HPTLC)从血清中检测出bmGT的方法。然而，血清的检测存在敏感性较低的弊端，基于局部器官和组织的标本检测可能会能更好地反映曲霉菌在人体中特定部位的分布情况。痰液是呼吸道分泌物，因此痰液中曲霉菌相关标志物的检测可能更直接地反映呼吸道曲霉菌的定植。此外，现有方法尚无法实现TAFC和bmGT这两种化合物的同时检测。因此，若能开发出从痰液中同时检测TAFC和bmGT的方法，对于深入研究曲霉菌在人体呼吸道的分布与定植情况、丰富TAFC和bmGT的检测途径、提高检测效率都将产生积极的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种痰液中TAFC和bmGT的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，以丰富TAFC和bmGT的检测途径，提高检测效率。本专利技术提供的痰液中TAFC和bmGT的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，步骤如下：(1)标样和试样的制备①将TAFC和bmGT用甲醇溶解，并用乙腈稀释得到一系列TAFC和bmGT浓度梯度变化的混合标准液；配制非那西丁溶液作为内标溶液；②取等体积的各混合标准液，向各混合标准液中分别加入等体积的空白痰液样品和等体积的内标溶液，然后混匀得到一系列混合液，分别向各混合液中加入萃取剂萃取2～3次，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮气保护下去除萃取剂，得一系列固态物质，将各固态物质分别用乙腈水溶液溶解并定容至同一体积，离心，所得一系列上清液即为标样；③向待测痰液样品中加入内标溶液并混匀，再向所得含内标的痰液样品中加入萃取剂萃取2～3次，合并萃取液并在氮气保护下去除萃取剂，将所得固态物质用乙腈水溶液溶解，然后离心，所得上清液即为试样；(2)标样和试样的测定采用液相色谱-串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中TAFC、bmGT和非那西丁的峰面积；色谱条件：采用AgilentExtendC18色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为0.1wt％～0.15wt％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相B的体积百分数为25％、流动相A的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相B的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相A的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min，洗脱液中流动相B的体积百分数为95％、流动相A的体积百分数为5％；质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500～3550V，干燥气温度350～360℃，干燥气流速5～6L/min，鞘气温度350～360℃，鞘气流速11～12L/min，DeltaEMV300～320V；测定醋酸镰孢氨酸C的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240V，碰撞电压为65V；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76V，碰撞电压为5V；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120V，碰撞电压为15V；(3)检测结果的获取以各标样中TAFC的浓度为横坐标，以各标样谱图中TAFC与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制TAFC的工作曲线；以各标样中bmGT的浓度为横坐标，以各标样谱图中bmGT与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制双甲硫基胶霉毒素的工作曲线；将试样谱图中TAFC与非那西丁的峰面积比值、bmGT与非那西丁的峰面积比值分别带入TAFC和bmGT的工作曲线的线性回归方程中，计算出试样中TAFC和bmGT的浓度。上述方法中，所述萃取剂为氯仿或二氯甲烷。上述方法方法的步骤(1)②中，每次萃取剂的加入量为含内标的混合工作液体积的3～4倍，步骤(1)③中，每次萃取剂的加入量为得到含内标的痰液样品体积的3～4倍。上述方法中，所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分数为35％～50％。上述方法中，将非那西丁用乙腈配制成非那西丁浓度为13～14ng/mL的溶液作为内标溶液。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术提供了一种从痰液中同时检测TAFC和bmGT的方法，为TAFC和bmGT的检测提供了新的途径，解决了现有方法无法实现TAFC和bmGT同时检测的不足，有利于提高检测效率。2.试验表明，本专利技术所述方法在1.56～100ng/mL浓度范围内对TAFC和bmGT具有良好的线性，检测TAFC和bmGT的日内、日间精密度相对标准偏差RSD不超过8％，符合小于15％的要求，准确度相对偏差RE不超过±9％，符合不超过±15％范围的要求。3.本专利技术所述方法采用常规试验仪器和试剂即可实现TAFC和bmGT的检测，操作简单，有利于推广应用。附图说明图1是实施例1中1#标样的谱图；图2是实施例1绘制的TAFC的工作曲线；图3是实施例1绘制的bmGT的工作曲线。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术所述痰液中TAFC和bmGT的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法作进一步说明。实施例中采用的仪器为Agilent1260-6460型高效液相色谱质谱联用仪。实施例1本实施例中，对标样进行测试，以考察本专利技术所述方法的线性范围，步骤如下：1.标样的制备(1)准确称量TAFC和bmGT置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到TAFC和bmGT浓度均为10mg/mL的混合储备液。取混合储备液7份，用乙腈稀释得到1#～7#混合标准液，1#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为15.63ng/mL，2#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为31.25ng/mL，3#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为62.50ng/mL，4#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为125.00ng/mL，5#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为250.00ng/mL，6#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为500.00ng/mL，7#混合标准液中TAFC和bmGT浓度均为1000.00ng/mL。(2)称取非本文档来自技高网...

【技术保护点】
痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱‑串联质谱同时检测方法，其特征在于步骤如下：(1)标样和试样的制备①将醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素用甲醇溶解，并用乙腈稀释得到一系列醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素浓度梯度变化的混合标准液；配制非那西丁溶液作为内标溶液；②取等体积的各混合标准液，向各混合标准液中分别加入等体积的空白痰液样品和等体积的内标溶液，然后混匀得到一系列混合液，分别向各混合液中加入萃取剂萃取2～3次，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮气保护下去除萃取剂，得一系列固态物质，将各固态物质分别用乙腈水溶液溶解并定容至同一体积，离心，所得一系列上清液即为标样；③向待测痰液样品中加入内标溶液并混匀，再向所得含内标的痰液样品中加入萃取剂萃取2～3次，合并萃取液并在氮气保护下去除萃取剂，将所得固态物质用乙腈水溶液溶解，然后离心，所得上清液即为试样；(2)标样和试样的测定采用液相色谱‑串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中醋酸镰孢氨酸C、双甲硫基胶霉毒素和非那西丁的峰面积；色谱条件：采用Agilent Extend C18色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为0.1wt％～0.15wt％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相B的体积百分数为25％、流动相A的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相B的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相A的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min，洗脱液中流动相B的体积百分数为95％、流动相A的体积百分数为5％；质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500～3550V，干燥气温度350～360℃，干燥气流速5～6L/min，鞘气温度350～360℃，鞘气流速11～12L/min，Delta EMV 300～320V；测定醋酸镰孢氨酸C的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240V，碰撞电压为65V；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76V，碰撞电压为5V；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120V，碰撞电压为15V；(3)检测结果的获取以各标样中醋酸镰孢氨酸C的浓度为横坐标，以各标样谱图中醋酸镰孢氨酸C与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制醋酸镰孢氨酸C的工作曲线；以各标样中双甲硫基胶霉毒素的浓度为横坐标，以各标样谱图中双甲硫基胶霉毒素与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制双甲硫基胶霉毒素的工作曲线；将试样谱图中醋酸镰孢氨酸C与非那西丁的峰面积比值、双甲硫基胶霉毒素与非那西丁的峰面积比值分别带入醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的工作曲线的线性回归方程中，计算出试样中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的浓度。...

【技术特征摘要】
1.痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，其特征在于步骤如下：(1)标样和试样的制备①将醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素用甲醇溶解，并用乙腈稀释得到一系列醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素浓度梯度变化的混合标准液；配制非那西丁溶液作为内标溶液；②取等体积的各混合标准液，向各混合标准液中分别加入等体积的空白痰液样品和等体积的内标溶液，然后混匀得到一系列混合液，分别向各混合液中加入萃取剂萃取2～3次，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮气保护下去除萃取剂，得一系列固态物质，将各固态物质分别用乙腈水溶液溶解并定容至同一体积，离心，所得一系列上清液即为标样；③向待测痰液样品中加入内标溶液并混匀，再向所得含内标的痰液样品中加入萃取剂萃取2～3次，合并萃取液并在氮气保护下去除萃取剂，将所得固态物质用乙腈水溶液溶解，然后离心，所得上清液即为试样；(2)标样和试样的测定采用液相色谱-串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中醋酸镰孢氨酸C、双甲硫基胶霉毒素和非那西丁的峰面积；色谱条件：采用AgilentExtendC18色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为0.1wt％～0.15wt％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相B的体积百分数为25％、流动相A的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相B的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相A的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min，洗脱液中流动相B的体积百分数为95％、流动相A的体积百分数为5％；质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500～3550V，干燥气温度350～360℃，干燥气流速5～6L/min，鞘气温度350～360℃，鞘气流速11～12L/min，DeltaEMV300～320V；测定醋酸镰孢氨酸C的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240V，碰撞电压为65V；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76V，碰撞电压为5V；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为...

【专利技术属性】
技术研发人员：付娟娟，肖威，宫德瀛，毛兵，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51