铁调素的结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及针对铁调素的新的、特异性结合的治疗和/或诊断蛋白，所述蛋白优选地是脂质运载蛋白的突变蛋白。本发明专利技术还涉及编码这样的蛋白的核酸分子和生成方法以及这样的蛋白和核酸分子的用途。相应地，本发明专利技术还涉及包含这样的脂质运载蛋白的药物和/或诊断组合物，包括这些蛋白的用途。

Hepcidin binding protein

The present invention relates to novel, specific binding therapeutic and / or diagnostic proteins for hepcidin, preferably a mutant protein of a lipid carrier protein. The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding such proteins and methods of formation, as well as the use of such proteins and nucleic acid molecules. Accordingly, the invention also relates to drugs and / or diagnostic compositions comprising such lipid carrying proteins, including the use of these proteins.

【技术实现步骤摘要】
铁调素的结合蛋白摘要本专利技术涉及针对铁调素(Hepcidin)的新的、特异性结合的治疗和/或诊断蛋白，所述蛋白优选地是脂质运载蛋白的突变蛋白。本专利技术还涉及编码这样的蛋白的核酸分子和生成方法以及这样的蛋白和核酸分子的用途。相应地，本专利技术还涉及包含这样的脂质运载蛋白的药物和/或诊断组合物，包括这些蛋白的用途。
技术介绍
铁调素，一种通常以由20或25个氨基酸形成的两种形式存在的肽激素，由大量细胞响应于铁加载和炎症而表达和分泌。铁调素主要在肝脏的肝细胞中产生，在铁动态平衡的调节中起到主要作用，作为一种抗菌肽以及直接或间接参与大多数铁缺乏/过载综合症的发展。铁调素的一个主要作用是内化和降解铁输出体膜铁转运蛋白(ferroportin)，所述膜铁转运蛋白在所有输出铁的细胞上表达。铁调素直接结合至膜铁转运蛋白。因此，高水平的铁调素导致小肠铁吸收和从巨噬细胞和肝细胞的铁释放的抑制，然而低浓度的铁调素导致从这些细胞的铁释放的加速。铁调素也可能在炎症性贫血和缺铁性贫血的发病机理中发挥作用。炎症性贫血，也称为慢性疾病贫血(ACD)或慢性障碍贫血，目前在住院患者中是最常见的贫血，并且是一种许多感染性、非感染性炎症和肿瘤障碍并发的常见综合症。ACD是一种正常红血球的、正常色素的贫血，以铁和铁结合能力(转铁蛋白)减少、铁蛋白增加和骨髓巨噬细胞中存在铁为特征，表明从其储存中调动铁的功能受损。然而在炎症性贫血中，铁调素水平增加，在缺铁性贫血中，发现铁调素水平较低。因此，铁调素可以用作区分这些疾病的标记物。铁调素也可以是用于筛选、预后和监控遗传性血色素沉着症及铁加载贫血的一个有用标记物。铁调素水平进一步可用于监测EPO治疗和预测对EPO的响应。分离、分析和量化铁调素的方法以及用于治疗与铁调素相关的疾病和病症的制剂已经被描述于国际专利申请WO2008/011158、WO2008/097461、WO2009/094551A1、WO2009/139822、WO2009/058797和WO2010/017070中。然而，在以前的描述中没有具有本专利技术提供的蛋白所赋有的特征的铁调素结合蛋白。专利技术概述本专利技术的一个实施方案涉及一种能够以测定的KD为约10nM或更低的亲和力结合铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白。更优选地，脂质运载蛋白可以具有测定的KD为约1nM或更低的亲和力。在另一个实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白能够中和人铁调素-25的生物活性，优选地具有约80nM或更低的IC50值，如通过用于铁调素诱导的膜铁转运蛋白的内化和降解的基于细胞的测定所测得。在特定的实施方案中，根据本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDNO:1-14的氨基酸序列。在另一个实施方案中，突变蛋白与野生型人脂质运载蛋白(包括人脂质运载蛋白2)的序列具有至少75％的同一性。在另一个实施方案中，本专利技术的突变蛋白与选自有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属络合物、金属和胶体金的化合物缀合。所述突变蛋白可以在其N端和/或C端融合至融合配偶体，所述融合配偶体是蛋白、蛋白结构域或肽。在另一个实施方案中，突变蛋白与延长突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合。进一步优选地，突变蛋白与选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白的化合物缀合。在另一个实施方案中，本专利技术的突变蛋白是铁调素的拮抗剂。所述铁调素可以是成熟人铁调素。在另一个实施方案中，本专利技术涉及包含编码本专利技术突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。在另一个实施方案中，本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白选自以下蛋白的突变蛋白：视黄醇结合蛋白(RBP)、胆汁三烯结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APOD)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、泪脂质运载蛋白(TLPC)、α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、vonEbners腺蛋白1(VEGP1)、vonEbners腺蛋白2(VEGP2)和主要变应原Canf1前体(ALL-1)。在相关的实施方案中，所述脂质运载蛋白突变蛋白选自人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)、人泪脂质运载蛋白(hTLPC)、人载脂蛋白D(APOD)和欧洲粉蝶(Pierisbrassicae)的胆汁三烯结合蛋白。在另一个实施方案中，本专利技术涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，其阻止人铁调素-25诱导的受试者的血清铁水平降低。本专利技术还涉及一种治疗与铁调素水平改变相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用含有本文所述的突变蛋白的药物组合物。在相关的实施方案中，所述疾病或障碍涉及铁动态平衡的障碍或与铁调素水平提高相关的炎性病症。附图说明图1示出了用于成熟Lcn2氨基酸序列中的20个氨基酸位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134(有下划线和编号的)的同时随机诱变的PCR组装策略。这20个位置被分为四个序列子集。对于每个子集中的氨基酸的随机化，合成了寡脱氧核苷酸(SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19)，其中在突变的密码子处采用核苷酸的NNK混合物。N是指所有四个碱基A、C、G和T的混合物，而K是指仅有两个碱基G和T的混合物，因此这样一种三联体编码所有20个自然氨基酸以及琥珀终止密码子TAG，其在用于噬菌粒生成和基因表达的大肠杆菌supE菌株XL1-blue(Bullock等人.,BioTechniques5(1987),376-378)或TG1(Sambrook等人.,MolecularCloning.ALaboratoryManual(1989),ColdSpringHarborPress)中被翻译成谷氨酰胺。在组装反应中还使用了四个额外的寡脱氧核苷酸(SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23)，所述寡脱氧核苷酸具有对应于非编码链(以3'-5'方向写在DNA双链序列之下)并且填充上述寡脱氧核苷酸之间的间隔的固定核苷酸序列。两个较短的侧翼寡脱氧核苷酸(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)，其被过量添加并携带生物素基团，用作该组装的完全合成的基因片段的PCR扩增引物。所述两个侧翼引物各包含BstXI限制性位点(CCANNNNNNTGG)，从而经酶消化产生相互不兼容的突出。这种特殊的限制性位点的排列使其能够特别高效地连接和克隆该合成基因。相对于原始的Lcn2序列，用氨基酸Gln28替代His对于引进第一个BstXI位点是必要的，而第二个自然存在于Lcn2的cDNA中。此外，未配对的残基Cys87在基因组装期间被Ser替换。在一锅式PCR后，生成的基因片段被插入到提供Lcn2结构基因的缺失部分的载体中。此图示还分别描述了在被两个BstXI限制性位点侧翼的盒的上游和下游的两个短引物(SEQIDNO:32和SEQIDNO:33)，其用于双链DNA测序。图2示出了合成的Lcn2基因的库的核苷酸序列(只示出了被两个B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够以KD为约10nM或低于约10nM的亲和力结合铁调素，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含：(a)在根据SEQ ID NO:35的NGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106任意处的至少2个突变的氨基酸残基；和(b)在对应于NGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134的序列位置任意处的至少1个突变的氨基酸残基；并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID No:1‑14的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。

【技术特征摘要】
2010.08.16 US 61/374,1991.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够以KD为约10nM或低于约10nM的亲和力结合铁调素，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含：(a)在根据SEQIDNO:35的NGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106任意处的至少2个突变的氨基酸残基；和(b)在对应于NGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134的序列位置任意处的至少1个突变的氨基酸残基；并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQIDNo:1-14的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。2.根据权利要求1所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与NGAL线性多肽序列具有至少75％的同一性。3.根据前述权利要求中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸替换集合中的一个：(a)Asn96→Val、Tyr100→Gln；(b)Asn96→Arg、Tyr100→Glu、Tyr106→Phe；(c)Asn96→Asp、Tyr100→Ser、Tyr106→Gly；(d)Asn96→Gly、Tyr100→Gly、Tyr106→Gly；(e)Asn96→Lys、Tyr100→Ala、Tyr106→Ile；(f)Asn96→Ser、Tyr100→Arg、Tyr106→Val；(g)Asn96→Ser、Tyr100→Val、Tyr106→Arg；或(h)Asn96→Thr、Tyr100→Val、Tyr106→Gly。4.根据前述权利要求中任一项所述的突变蛋白，其中相对于NGAL线性多肽序列，所述突变蛋白包含选自以下的至少一个氨基酸替换：Leu36→Ala、Cys、Thr、或Val；Ala40→Arg、Glu、Gly、或Ser；Ile41→Ile、Leu、Met、或Val；Gln49→Leu或Met；Leu70→Asp、Asn、Gln、Met、或Phe；Arg72→Glu、Gly、Leu、或Val；Lys73→Ala、Arg、Glu、Gly、Leu、Thr、或Tyr；Asp77→Arg、Glu、Gly、Leu、Ser、或Val；Trp79→Gly、Leu、Ser、Tyr、或Val；Leu103→Ala、Arg、Gly、或Trp；Lys125→Arg、Leu、Met、Phe、Thr、或Val；和Tyr132→Leu或Val。5.根据前述权利要求中任一项所述的突变蛋白，其包含以下突变中的至少1个：Leu36→Thr、Leu36→Val、Leu36→Ala、Ala40→Ser、Ala40→Gly、Ala40→Glu、Ala40→Arg、Ile41→Val、Ile41→Leu、Ile41→Met、Gln49→Leu、Gln49→Met、Tyr52→His、Tyr52→Leu、Tyr52→Phe、Tyr52→Trp、Ser68→Arg、Ser68→Gly、Ser68→Ile、Leu70→Phe、Leu70→Asn、Leu70→Gln、Leu70→Met、Leu70→Asp、Arg72→Glu、Arg72→Val、Arg72→Gly、Arg72→Leu、Lys73→Gly、Lys73→Arg、Lys73→Ala、Lys73→Thr、Lys73→Tyr、Lys73→Glu、Asp77→Arg、Asp77→Val、Asp77→Ser、Asp77→Glu、Asp77→Gly、Asp77→Leu、Trp79→Val、Trp79→Tyr、Trp79→Ser、Trp79→Gly、Trp79→Leu79、Arg81→Glu、Arg81→Ser、Arg81→Gly、Arg81→Gln、Asn96→Lys、Asn96→Arg、Asn96→Thr、Asn96→Ser、Asn96→Asp、Asn96→Val、Tyr100→Ala、Tyr100→Glu、Tyr100→Val、Tyr100→Arg、Tyr100→Ser、Tyr100→Gln、Leu103→Gly、Leu103→Arg、Leu103→Ala、Leu103→Gly、Leu103→Arg、Leu103→Trp、Tyr106→Ile、Tyr106→Phe、Tyr106→Val、Tyr106→Gly、Tyr106→Arg、Lys125→Val、Lys125→Met、Lys125→Arg、Lys125→Leu、Lys125→Thr、Lys125→Phe、Ser127→Trp、Ser127→Thr、Tyr132→Leu、Tyr132→Val、和Lys134→Trp。6.根据前述权利要求中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸组合集合中的一个：(a)Ala36、Ser40、Leu41、Met49、Asn70、Gly72、Gly73、Ser77、Leu79、Leu125、Val132；(b)Leu36...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·特伦特曼，G·马钦内尔，A·斯克拉，A·霍尔鲍姆，M·胡尔斯迈尔，H·吉勒，HJ·克里斯蒂安，K·延森，R·S·贝莱巴，
申请(专利权)人：皮里斯制药有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE