在红冬孢酵母属和红酵母属物种中高效产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法技术

本发明专利技术涉及真菌生物技术领域，更特别是在选自红冬孢酵母属和红酵母属的真菌宿主中产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的遗传工程方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在红冬孢酵母属和红酵母属物种中高效产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法相关申请的交叉引用本申请涉及并要求2014年9月8日提交的美国临时专利申请系列号62/047,300的优先权。该申请整体援引加入本文。序列提交本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2577237PCTSequenceListing.txt，2015年7月2日创建，并且大小为321kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。专利技术背景本专利技术涉及真菌生物
，更特别是在选自红冬孢酵母属(Rhodospordium)和红酵母属(Rhodotorula)的真菌宿主中产生ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的遗传工程方法。本文中用来说明本专利技术的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料援引加入本文，并且为了方便，分别分组在参考文献中。Omega-3脂肪酸(也称作ω-3脂肪酸或n-3脂肪酸)是指α-亚麻酸(ALA)[(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-十八碳三烯酸]、EPA(二十碳五烯酸，或[(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸])和DHA[二十二碳六烯酸，或(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸]。动物ω-3EPA和DHA脂肪酸的常见来源包括鱼油、卵油、乌贼油和磷虾油，而一些植物油如来自沙棘籽和浆果、藻类细胞、亚麻籽、奇亚籽和火麻仁的油包含高水平的ALA。亚油酸[(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸]、γ-亚麻酸(GLA，或all-cis-6,9,12-十八碳三烯酸)和花生四烯酸[(5Z,8Z,11Z,14Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸])是ω-6脂肪酸。GLA是主要在基于植物的油如琉璃苣种子油、月见草油和黑醋栗种子油中发现的ω-6脂肪酸。ω-3脂肪酸对于正常代谢是至关重要的。据认为ω-3是必需脂肪酸，即，不可以通过人体合成，除了哺乳动物具有有限能力，当饮食包括短链ω-3脂肪酸ALA时，以形成更重要的长链ω-3脂肪酸EPA，然后从EPA，以甚至更低的效率形成最重要的DHA。现在接受ω-3多不饱和脂肪酸，特别是EPA和DHA在人类健康的许多方面起重要作用。但是，过度捕捞和关于海洋环境污染的担心表明需要开发极长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA)如EPA和DHA的可选的可持续来源[1]。据认为ω-6脂肪酸是必需脂肪酸：它们对于人类健康是必需的。连同ω-3脂肪酸，ω-6脂肪酸在脑功能以及正常生长和发育中起到至关重要的作用。ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸有助于刺激皮肤和毛发生长，保持骨骼健康，调节代谢，以及维持生殖系统[2]。一些初步临床研究表明GLA可能可用于糖尿病性神经病、类风湿性关节炎、过敏、湿疹、高血压(Hypertension)、绝经期症状等。据认为ω-6和ω-3必需脂肪酸的膳食摄入比例对于人体健康很重要[3]。到目前为止已报道大量产油微生物。它们产生的油(常称作单细胞油(SCO))与植物的相似，并且可以用于生产生物柴油、食品和工业产品[4-6]。SCO现在在市场上被广泛接受，并且越来越意识到PUFA如γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、DHA和EPA的健康益处。ARA和DHA还已在世界许多地方用于强化婴儿配方。鱼油是DHA和EPA的丰富来源，并且有限数量的植物油料种子是其他PUFA的良好来源。海洋原生生物和沟鞭藻类如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)和Crypthecodinium的物种是DHA的丰富来源，而微藻如褐指藻属(Phaeodactylum)和Monodus是EPA的良好来源。低等真菌被孢霉属(Mortierella)的物种在脂质级分中积累高百分比的ARA[7]。虽然酵母解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)可能作为SCO的生物工程宿主享有悠久的研究和开发历史[8-12]，但是圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(也称作Rhodotorulaglutenis)已吸引越来越多的关注，这是由于其能够以快速生长速度进行较高的细胞密度发酵，高效产生具有>67％(w/w干细胞质量)油含量的细胞团块[13-16]。柄锈菌亚门(Pucciniomycotina)是担子菌门(Basidiomycota)中的真菌亚门[17]。其拥有许多具有重要工业应用的物种。例如，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和锁掷酵母属(Sporidiobolus)中的许多物种如圆红冬孢酵母(也称作瘦弱红酵母(Rhodotorulagracilis)、Rhodosporidiumglutinis、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、Torulakoishikawensis和Torularubescens)和赭色掷孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)是能够高密度发酵的富含油的单细胞酵母[6,18]。这些物种拥有巨大潜力作为宿主用于产生长链烃，如三酰甘油(TAG，或脂肪)、脂肪酸酯(生物柴油)、脂肪醇、醇、内酯、萜类化合物和维生素[14,19-21]。红冬孢酵母属和红酵母属基因组是高度富含GC的，已发现这深刻影响遗传转化和蛋白表达[22-24]。代谢工程是提高植物和微生物中的代谢物生成的有效技术。在ω-3脂肪酸的生物工程方面，在植物和产油酵母中表达各种去饱和酶和延长酶对于PUFA的产生至关重要[25]。GLA通过Δ6-去饱和酶合成自亚油酸(LA；C18:2Δ9,12cis)。红花(Carthamustinctorius)的种子油包含高LA，并且已通过用来自高山被孢霉(Mortierellaalpina)和异枝水霉(Saprolegniadiclina)的Δ6-去饱和酶转化进行修饰以分别获得超过50％(v/v)的GLA[26]。ALA和GLA是产生较长链ω-3脂肪酸如花生四烯酸(AA)、EPA和二十二碳六烯酸(DHA)的前体[7,27]。因此，以高容积生产率产生高水平的ALA和GLA的能力对于圆红冬孢酵母中较长链PUFA的生物工程至关重要。因此，需要开发产生高水平的ALA和GLA(然后在真菌物种中可用于产生较长链PUFA)的红冬孢酵母属和红酵母属的真菌物种。专利技术概述本专利技术涉及真菌生物
，更特别是在选自红冬孢酵母属和红酵母属的真菌宿主中产生ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的遗传工程方法。在第一方面，本专利技术提供一种真菌宿主，其具有以所述真菌宿主细胞中总脂肪酸的至少9％量存在的α-亚麻酸(ALA)。在一实施方案中，所述真菌宿主是红冬孢酵母属的物种。在另一实施方案中，所述真菌宿主是红酵母属的物种。在一些实施方案中，所述真菌宿主具有减少的天然醛脱氢酶(ALD)活性，所述天然醛脱氢酶(ALD)使用脂肪酸醛作为底物。所述天然ALD由天然ALD基因编码。在一实施方案中，所述天然ALD基因编码具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的醛脱氢酶(ALD)。在另一实施方案中，所述天然ALD基因编码具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真菌宿主细胞，其中在所述真菌宿主细胞中总脂肪酸包含水平为至少9％，优选超过24％，最优选超过49％的升高水平的多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是α‑亚麻酸(ALA)或γ‑亚麻酸(GLA)，其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰使得所述真菌宿主细胞与具有未修饰的基因组的真菌宿主细胞相比具有减少的天然醛脱氢酶(ALD1)酶活性，并且其中所述真菌宿主是红冬孢酵母属(Rhodosporidium)或红酵母属(Rhodotorula)的物种。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.08 US 62/047,3001.一种真菌宿主细胞，其中在所述真菌宿主细胞中总脂肪酸包含水平为至少9％，优选超过24％，最优选超过49％的升高水平的多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是α-亚麻酸(ALA)或γ-亚麻酸(GLA)，其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰使得所述真菌宿主细胞与具有未修饰的基因组的真菌宿主细胞相比具有减少的天然醛脱氢酶(ALD1)酶活性，并且其中所述真菌宿主是红冬孢酵母属(Rhodosporidium)或红酵母属(Rhodotorula)的物种。2.权利要求1的真菌宿主细胞，其中所述天然ALD1选自：(a)具有SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列的ALD1；以及(b)与SEQIDNO:3中示出的氨基酸序列具有至少75％相同性或至少85％相同性或至少95％相同性的ALD1。3.权利要求2的真菌宿主细胞，其中所述天然ALD1由选自以下的核酸编码：(a)具有SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列的核酸；(b)具有SEQIDNO:2中示出的核苷酸序列的核酸；(c)与(a)的核酸具有至少75％相同性或至少85％相同性或至少95％相同性的核酸；以及(d)与(b)的核酸具有至少75％相同性或至少85％相同性或至少95％相同性的核酸。4.权利要求1-3中任一项的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞具有缺陷的编码ALD1的基因，导致Ald1酶活性丧失。5.权利要求4的真菌宿主细胞，其中所述缺陷的基因是由T-DNA插入、同源重组或定点诱变引起的。6.权利要求1-3中任一项的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞的基因组已被修饰以下调天然ALD1基因的表达，导致Ald1酶活性丧失或减少。7.权利要求6的真菌宿主细胞，其中所述表达是通过人工转录阻遏物、RNAi、siRNA、shRNA、miRNA、反义或有义抑制下调的。8.权利要求1-7中任一项的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞的基因组已被进一步修饰以包括至少两个表达盒，其中每个表达盒包含可操作地连接至编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的核酸，并且其中所述蛋白选自：(a)酰基-CoAδ-12去饱和酶；(b)硬脂酰-CoA-δ-9-去饱和酶；(c)ω-3去饱和酶；(d)脂肪酸延长酶；(e)酰基-CoA羧化酶(ACC)；(f)ATP:柠檬酸裂解酶(ACL)；(g)二酰甘油酰基转移酶(DGA)；(h)苹果酸酶(MAE)；(i)酰基-CoAδ-6去饱和酶。9.权利要求8的真菌宿主细胞，其中所述表达盒进一步包含可操作地连接至编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的核酸的转录终止子。10.权利要求8或9的真菌细胞，其中所述核酸的编码序列包含至少55％C和G，优选60％-70％C和G，其中至少70％的密码子在第3位具有C或G。11.权利要求8-10中任一项的真菌细胞，其中所述蛋白选自：(a)酰基-CoAδ-12去饱和酶，其具有SEQIDNO:5和或SEQIDNO:94中示出的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列具有至少80％或至少90％或至少95％相...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·刘，C·M·许，纪良辉，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG