作为疫苗有用的经基因修饰的球虫寄生虫制造技术

本发明专利技术涉及磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的表达被破坏的经基因修饰的球虫寄生虫，以及包含编码磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的核苷酸序列的多核苷酸，该磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)催化脂质磷脂酰苏氨酸（PtdThr）的产生。PtdThr是选择的球虫寄生虫中独有的、主要的和生理上重要的脂质，其是球虫寄生虫的正常生长和毒性所需的。具有如本文所述的被破坏的PTS表达的球虫寄生虫，作为疫苗是有用的。磷脂酰苏氨酸合酶及编码其序列的核苷酸以及磷脂酰苏氨酸磷脂能够用于诊断方法和诊断试剂盒或用于疫苗和药物开发应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为疫苗有用的经基因修饰的球虫寄生虫本专利技术涉及磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的表达被破坏的球虫寄生虫，涉及包含编码磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的核苷酸序列的多核苷酸，涉及磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)，并且涉及磷脂酰苏氨酸(PtdThr)脂质。具有如本文所述的被破坏的PTS表达的球虫寄生虫，作为疫苗是有用的。磷脂酰苏氨酸合酶及编码其序列的核苷酸以及磷脂酰苏氨酸磷脂能够用于诊断方法和诊断试剂盒或用于疫苗和药物开发应用。球虫寄生虫例如弓形虫(Toxoplasma)种、艾美耳球虫(Eimeria)种和新孢子虫(Neospora)种是单细胞病原体，其在全世界造成重大的社会经济负担。弓形体(例如，刚地弓形虫)是广泛的寄生虫，其感染人类以及几乎所有其他恒温生物体。寄生虫对有食用和经济价值的家畜(例如，羊和猪)以及人类健康是重大威胁。寄生虫在免疫抑制个体和新生儿中引起脑弓形体病和眼弓形体病。它也可以造成人类和动物的先天性疾病，导致自然流产和胎儿异常。类似地，艾美耳球虫(例如，柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella))和新孢子虫(例如，犬新孢子虫(Neosporacaninum))分别是家禽业(引起例如鸡腹泻)和养牛业(引起例如母牛流产)的主要关注点。类似于弓形虫，新孢子虫寄生虫也在神经系统中形成组织囊肿，其不能通过可用药物治愈，因而在受感染的宿主的整个生命中持续存在。这些囊肿可以在免疫应答下降时，例如由HIV-AIDS感染导致的或器官移植期间的或仅仅由老年人群中的老龄化导致的，恢复活性而引起潜在的致命性急性感染。因此，显然需要用于处理球虫寄生虫感染的预防方法，特别是尚不能治愈的囊肿(慢性)感染。可获得一种商业抗弓形虫的活疫苗(Toxovax),其包括活的弱毒刚地弓形虫S48菌株(Buxton,D.(1993),Toxoplasmosis:thefirstcommercialvaccine(弓形虫病:第一种商业疫苗),Parasitologytoday(Personaled.),9(9),335–7(review)；VermaR.andKhannaP.(2013)DevelopmentofToxoplasmagondiivaccine:Aglobalchallenge(刚地弓形虫疫苗的发展：全球挑战),HumVaccinImmunother.,2013Feb；9(2):291-3(review))。这种疫苗用于兽医用途。然而，它具有若干缺点：昂贵，引起副作用，具有短的储存期，并且基因无特征(geneticallyuncharacterized)。此外，因为它易感而回复其致病毒性，因而不适合人类使用。专利技术人已经确定了一种在球虫寄生虫中表达的新型酶(磷脂酰苏氨酸合酶，PTS)，该球虫寄生虫在所有哺乳动物宿主中都不存在，并且产生一种被称为磷脂酰苏氨酸(PtdThr)的独有膜脂质。值得注意的是，PtdThr先前被报道为在某些哺乳动物细胞和选定的原核生物中罕见的且特别小的PtdSer类似物(J.Mitoma,T.Kasama,S.Furuya,Y.Hirabayashi,Occurrenceofanunusualphospholipid,phosphatidyl-L-threonine,inculturedhippocampalneurons.ExogenousL-serineisrequiredforthesynthesisofneuronalphosphatidyl-L-serineandsphingolipids.(培养的海马神经元中发现不常见的磷脂——磷脂酰-L-苏氨酸。外源L-丝氨酸是合成磷脂酰-L-丝氨酸和鞘脂所需要的),TheJournalofBiologicalChemistry273,19363–19366(1998)；P.T.Ivanova,S.B.Milne,H.A.Brown,Identificationofatypicalether-linkedglycerophospholipidspeciesinmacrophagesbymassspectrometry.(通过质谱分析法鉴定巨噬细胞中的非典型的醚链连接的甘油磷脂),JournalOfLipidResearch51,1581–1590(2010)；F.D.Müller,S.Beck,E.Strauch,M.W.Linscheid,Bacterialpredatorspossessuniquemembranelipidstructures.(细菌捕食者拥有独特的膜脂质结构),Lipids46,1129–40(2011)；L.Heikinheimo,P.Somerharju,Translocationofphosphatidylthreonineand-serinetomitochondriadiminishesexponentiallywithincreasingmolecularhydrophobicity.(磷脂酰苏氨酸和磷脂酰丝氨酸向线粒体的转运随着分子疏水性的增加而指数地减少),Traffic3,367–77(2002))，偶尔对细胞生理学有相当有害的影响(J.Mitoma,T.Kasama,S.Furuya,Y.Hirabayashi,Occurrenceofanunusualphospholipid,phosphatidyl-L-threonine,inculturedhippocampalneurons.ExogenousL-serineisrequiredforthesynthesisofneuronalphosphatidyl-L-serineandsphingolipids.,TheJournalofBiologicalChemistry273,19363–19366(1998))。结果表明，哺乳动物细胞中的碱性交换型磷脂酰丝氨酸合酶(PSS)通常使用丝氨酸作为其主要底物，在丝氨酸缺失的条件下也可产生PtdThr作为副产物。在正常条件下，真核细胞不产生任何可检测量的PtdThr。相反，专利技术人揭露了PtdThr在广泛的真核病原体例如T.gondii(刚地弓形虫)和E.tenella(柔嫩艾美耳球虫)中出人意料地丰富和自然产生。专利技术人还发现PTS的破坏消除了PtdThr的从头合成，并且损害了球虫寄生虫例如T.gondii的无性繁殖生命周期。特别地，专利技术人已经发现，这种修饰的寄生虫是无毒的，并且给予针对寄生虫引起的疾病的保护，例如小鼠的急性和慢性弓形虫病。在哺乳动物细胞中不产生PTS和PtdThr意味着PTS被破坏的寄生虫不能从宿主细胞获得足够的PtdThr来补偿它们的PtdThr缺乏。这使得具有被破坏的PTS表达的球虫寄生虫无毒并且作为疫苗有用，特别是对于经常被T.gondii感染的农场动物和食用动物有用。因此，本专利技术涉及一种选自弓形虫种、新孢子虫种和艾美耳球虫种的球虫寄生虫，其中磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的表达被破坏从而减少或消除磷脂酰苏氨酸(PtdThr)的合成。合适的球虫寄生虫包括弓形虫种、新孢子虫种和艾美耳球虫种。可能特别地提及刚地弓形虫(也称为T.gondii或Tg)、犬新孢子虫(也称为N.canium或Nc)和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自弓形虫种、新孢子虫种和艾美耳球虫种的球虫寄生虫，其中磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的表达被破坏从而减少或消除磷脂酰苏氨酸(PtdThr)的合成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.16 EP 14185015.61.一种选自弓形虫种、新孢子虫种和艾美耳球虫种的球虫寄生虫，其中磷脂酰苏氨酸合酶(PTS)的表达被破坏从而减少或消除磷脂酰苏氨酸(PtdThr)的合成。2.如权利要求1所述的球虫寄生虫，所述球虫寄生虫选自刚地弓形虫、犬新孢子虫和柔嫩艾美耳球虫，或者所述球虫寄生虫是刚地弓形虫。3.如权利要求1或2所述的球虫寄生虫，其中所述PtdThr是式(I)所示的PtdThr:(I)其中R1和R2独立地选自具有8至46个碳原子的饱和酰基和/或具有8至46个碳原子的不饱和酰基。4.如权利要求1至3中任一所述的球虫寄生虫，其中所述PTS酶的表达通过使相应的PTS编码基因失活或删除相应的PTS编码基因被破坏。5.如权利要求1至4中任一所述的球虫寄生虫，其中所述PTS酶的表达通过灭活或删除编码与刚地弓形虫PTS(SEQIDNo.2)、犬新孢子虫PTS(SEQIDNo.4)或柔嫩艾美耳球虫PTS(SEQIDNo.6)具有至少30%的一致性的蛋白质序列的核苷酸序列被破坏，特别地所述蛋白质序列与刚地弓形虫PTS(SEQIDNo.2)、犬新孢子虫PTS(SEQIDNo.4)或柔嫩艾美耳球虫PTS(SEQIDNo.6)具有至少50%的一致性，更特别地具有至少75%的一致性，进一步特别地具有至少90%的一致性，更进一步特别地具有至少95%的一致性，还具有至少99%的一致性。6.如权利要求1至5中任一所述的球虫寄生虫，其中所述PTS酶的表达通过删除或替换多核苷酸序列被破坏，所述多核苷酸序列包括编码用于PTS的催化位点的核苷酸。7.如权利要求1至6中任一所述的球虫寄生虫用作疫苗。8.一种用于制备如权利要求1至7中任一所述的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼西斯·古普特，鲁本·阿罗佑欧拉特，理查德·卢修斯，乔斯·布劳韦斯，J贝恩德·赫尔姆斯，艾尔迪克·杜内，
申请(专利权)人：柏林洪堡大学，乌得勒支大学控股有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE