本发明专利技术提供可用于调节免疫系统的不同的方法和组合物。组合物包括包含以下的融合蛋白：(a)包含白介素‑2 (IL‑2)或其功能变体或片段的第一多肽；和(b)与第一多肽符合阅读框融合的第二多肽，其中第二多肽包含白介素‑2受体α (IL‑2Rα)的胞外结构域或其功能变体或片段，且其中所述融合蛋白具有IL‑2活性。本发明专利技术提供用于调节受试者的免疫应答的多种方法，所述方法包括给予需要治疗的受试者治疗有效量的本文公开的IL‑2/IL‑2Rα融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】白介素-2/白介素-2受体α融合蛋白和使用方法专利
本公开主题总的来讲涉及使用白介素-2/白介素-2受体α融合蛋白调节免疫应答的方法和组合物。参照通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表序列表的正式拷贝遵照美国信息交换标准代码(AmericanStandardCodeforInformationInterchange，ASCII)通过EFS-Web以文本文件与说明书同时提交，文件名为464173seqlist.txt，创建日期为2015年7月30日，大小为139KB。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用以其整体结合到本文中。联邦政府资助声明本专利技术在由NationalInstituteofHealth(NIH),NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases(NIDDK)授予的资助号R01DK093866的政府支持下完成。政府在本专利技术中享有某种权利。专利技术背景白介素-2(IL-2)是用于试图增强癌症和HIV/AID患者的免疫应答的生物制剂。最近，较低剂量的IL-2被用来选择性提高耐受性用以抑制与自体组织的自身免疫样攻击有关的不想要的免疫应答。重要的是，这些低剂量的IL-2并不显示自体反应性T细胞增强或再激活的任何迹象。然而，IL-2作为治疗剂具有重大缺点，其包括极短的体内半寿期(这限制其功效)和高剂量下的毒性。出于这些原因，需要具有改进的药代动力学和对使用反应的耐久性的新的IL-2生物制剂。专利技术概述提供可用于调节免疫系统的不同的方法和组合物。组合物包括包含以下的融合蛋白：(a)包含白介素-2(IL-2)或其功能变体或片段的第一多肽；和(b)与第一多肽符合阅读框融合的第二多肽，其中第二多肽包含白介素-2受体α(IL-2Rα)的胞外结构域或其功能变体或片段，且其中融合蛋白具有IL-2活性。提供用于降低受试者的免疫应答的不同方法，所述方法包括给予需要降低免疫应答的受试者治疗有效量的本文公开的IL-2/IL-2Rα融合蛋白。进一步提供用于提高受试者的免疫应答的方法，所述方法包括给予需要提高免疫应答的受试者治疗有效量的本文公开的IL-2/IL-2Rα融合蛋白。进一步提供用于提高调节性T细胞活性的方法。包括提高疫苗的免疫原性或克服受试者中对疫苗的受抑制的免疫应答的其它方法，其包括：(a)给予受试者治疗有效量的本文公开的IL-2/IL-2Rα融合蛋白；和(b)给予受试者疫苗，其中融合蛋白提高疫苗的免疫原性或克服对疫苗的受抑制的免疫应答。附图简述图1提供IL-2/IL-2Rα融合蛋白的示意图，其中L=前导肽，LK=接头区，G=甘氨酸，H=组氨酸，T=终止密码子。图2A和图2B提供IL-2/IL-2Rα融合蛋白的非限制性实例的推导蛋白质序列。图2A提供小鼠IL-2/IL-2Rα融合蛋白的非限制性实例的推导的蛋白质序列。上下部分分别显示融合蛋白的小鼠IL-2和IL-2Rα的序列。标为IL-2的序列以SEQIDNO:3列出；标为IL-2-(G4S)4-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:54列出；标为IL-2-(G4S)5-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:55列出；标为IL-2-(G3S)4-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:56列出；标为IL-2-(G3S)3-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:57列出；IL-2Rα的胞外结构域以SEQIDNO:10列出。图2B提供人IL-2/IL-2Rα融合蛋白的非限制性实例的推导的蛋白质序列。上下部分分别显示融合蛋白的人IL-2和IL-2Rα的序列。标为IL-2的序列以SEQIDNO:1列出；标为IL-2-(G3S)2-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:58列出；标为IL-2-(G3S)3-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:59列出；标为IL-2-(G3S)4-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:60列出；标为IL-2-(G4S)4-IL-2Rα的序列以SEQIDNO:61列出；IL-2Rα的胞外结构域以SEQIDNO:7列出。图3显示IL-2/IL-2Rα融合蛋白的生物活性。COS-7细胞用具有指定接头的IL-2/IL-2Rα融合物cDNA转染。将来自这些细胞的上清液与抗CD3激活的T母细胞(Tcellblast)一起培养以评价IL-2活性。(A)在指定的融合蛋白稀释后T母细胞的增殖反应。(B)抗IL-2对由含有指定的融合蛋白的培养上清液的1:2稀释刺激的增殖的作用。图4显示纯化的IL-2/IL-2Rα融合蛋白的活性。通过对6x-His标签的基于镍的亲和层析法，使用转染的CHO细胞的上清液纯化IL-2/(G3S)3/IL-2Rα和IL-2/(G1y4Ser)4/IL-2Rα。(A)通过抗CD3T母细胞增殖对规定的纯化融合蛋白的IL-2生物活性度量（IL-2bioactivitymeasurebyproliferationofanti-CD3Tcellblasttotheindicatedpurifiedfusionprotein）。(B)各纯化的融合蛋白抑制针对非配体结合部位的PC61和7D4抗IL-2Rα单克隆抗体与抗CD3激活的T母细胞结合的作用。图5显示针对IL-2Rα的IL-2结合部位的单克隆抗IL-2Rα抗体无法与IL-2/IL-2Rα融合蛋白结合。首先将具有规定的可变接头的纯化的融合蛋白与针对IL-2Rα的配体结合部位的3C7抗IL-2Rα单克隆抗体或针对IL-2Rα的非配体结合部位的7D4单克隆抗体一起孵育。使用IL-2Rα转染的EL4细胞，评价3C7或7D4随后与细胞表面IL-2Rα结合的能力。图6显示纯化的IL-2R/IL-2Rα的生化性质。(A)在还原和非还原条件下对纯化的IL-2/IL-2Rα进行SDS-PAGE；通过用针对融合蛋白的6x-His标签的抗体探测，通过蛋白质印迹分析观察IL-2/IL-2Rα。(B)在还原条件下对指定量的纯化的IL-2/(Gly3Ser)3/IL-2Rα进行SDS-PAGE，接着考马斯蓝染色。图7显示IL-2/IL-2Rα融合蛋白对体内IL-2依赖性信号转导的作用。C57BL/6小鼠接受IL-2/(G3S)3/IL-2Rα的单次腹膜内注射(4000单位的IL-2活性)，并立即评价指定脾细胞群中的pSTAT5水平。在注射IL-2/IL-2Rα融合蛋白后0.5小时测定pSTAT5水平。对于CD4+T细胞，对细胞进行选通（gate）以排除Foxp3+Treg细胞。图8显示IL-2/IL-2Rα融合蛋白体内对Treg细胞的作用。用与IL-2/(G3S)3/IL-2Rα有关的IL-2活性的指定量给NOD小鼠腹膜内注射3次(第1、3、5天)。在最后一次注射后24小时，针对脾、胰淋巴结(PLN)和胰评价对Treg的作用。所评价的是CD4+T细胞中Treg的比例；在归一化至对照治疗小鼠的Treg的CD25表达后Treg的CD25表达的平均荧光强度(MFI)；通过增殖标志物Ki67的表达评价的Treg的增殖状况和表达Klrgl的Treg的%，这标明IL-2依赖性终末分化亚群。图9显示IL-2/IL-2Rα融合蛋白和重组IL-2体内诱导T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其包含：(a) 包含白介素‑2 (IL‑2)或其功能变体或片段的第一多肽；和(b) 与所述第一多肽符合阅读框融合的第二多肽，所述第二多肽包含白介素‑2受体α (IL‑2Rα)的胞外结构域或其功能变体或片段，其中所述融合蛋白具有IL‑2活性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.06 US 62/0337261.一种融合蛋白，其包含：(a)包含白介素-2(IL-2)或其功能变体或片段的第一多肽；和(b)与所述第一多肽符合阅读框融合的第二多肽，所述第二多肽包含白介素-2受体α(IL-2Rα)的胞外结构域或其功能变体或片段，其中所述融合蛋白具有IL-2活性。2.权利要求1的融合蛋白，其中当与天然或重组IL-2相比时，所述融合蛋白的IL-2效能提高。3.权利要求1或2中任一项的融合蛋白，其中当与天然或重组IL-2相比时，所述融合蛋白的携带IL-2R的淋巴细胞的持久性IL-2刺激在体内增强。4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中(a)包含IL-2的所述第一多肽与SEQIDNO:2共享至少70%序列同一性；和/或，(b)包含IL-2Rα的胞外结构域的所述第二多肽与SEQIDNO:7共享至少70%序列同一性。5.权利要求4的融合蛋白，其中(a)包含IL-2的所述第一多肽与SEQIDNO:2共享至少85%、90%、95%或99%序列同一性；和/或，(b)包含IL-2Rα的胞外结构域的所述第二多肽与SEQIDNO:7共享至少85%、90%、95%或99%序列同一性。6.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其另包含在所述第一多肽和所述第二多肽之间符合阅读框融合的接头序列。7.权利要求6的融合蛋白，其中所述接头序列包含：(a)甘氨酸/丝氨酸接头；(b)SEQIDNO:11、12、13、14、15、40、41、50、51或52列出的序列；或(c)与SEQIDNO:11、12、13、14、15、40、41、50、51或52的任一个具有最少90%或95%序列同一性的序列。8.权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含(a)SEQIDNO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、36、37、38、39、43、44、45、46、54、55、56、57、58、59、60或61的任一个的氨基酸序列；或，(b)与SEQIDNO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、36、37、38、39、43、44、45、46、54、55、56、57、58、59、60或61的任一个具有至少80%、85%、90%或95%的序列。9.权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白在IL-2Rα的胞外结构域中包含至少一个突变。10.权利要求9的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：(a)SEQIDNO:62或64的任一个的氨基酸序列；或(b)与SEQIDNO:62或64的任一个具有至少80%、85...
【专利技术属性】
技术研发人员：T马列克，
申请(专利权)人：迈阿密大学，
类型：发明
国别省市：美国,US
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