嵌合自身抗体受体T细胞的组合物和方法技术

本发明专利技术包括包含对自身抗体特异的至少一种嵌合自身抗体受体(CAAR)的组合物，包括其的载体，包括包装在病毒颗粒中的CAAR载体的组合物和包括CAAR的重组T细胞。本发明专利技术还包括制备表达CAAR(CAART)的遗传修饰的T细胞的方法，其中该所表达的CAAR包括桥粒芯蛋白胞外结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合自身抗体受体T细胞的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,989的优先权和权益，该申请通过引用以其全文并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的AR057001在政府支持下进行。政府在本专利技术中享有一定的权利。
技术介绍
自身免疫是美国第三最常见的疾病类型，影响8％的人口。有两种基本类型的自身免疫性疾病：主要由T细胞引起的那些，以及主要由B细胞和它们产生的自身抗体引起的那些。寻常性天疱疮(PV)是模型自身抗体介导的疾病，其中针对皮肤细胞粘附蛋白桥粒芯蛋白3(Dsg3)的自身抗体引起皮肤和粘膜的潜在致命的起泡。目前的疗法集中于一般免疫抑制以减少所有抗体，但这些策略还靶向保护我们免受感染的良好抗体。因为天疱疮是慢性缓解-复发性疾病，所以这种治疗与多种副作用相关，包括致命感染和继发性癌症的风险。例如，已报道利妥昔单抗(抗CD20单克隆抗体试剂)在治疗寻常性天疱疮中具有优异的功效，其中95％的患者在3个月内实现水疱的完全愈合，并且35％的患者在长期随访期间实现所有全身治疗的完全缓解。然而，大于80％的患者将复发(大概因为利妥昔单抗的CD20+B细胞消耗的功效通常是不完全的)，并且严重感染并不罕见，据报道在7％的用利妥昔单抗治疗的自身免疫性疾病患者中发生，其中致命感染为1％-2％。因此，患有严重自身免疫性疾病(如寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮或落叶型天疱疮)的患者不再因其疾病而死亡，而是患有治疗并发症。然而，目前不存在PV的治疗仅靶向自身反应性B细胞的治疗策略。系统性皮质类固醇、硫唑嘌呤、霉酚酸酯和环磷酰胺在治疗PV方面有效，但非特异性抑制淋巴细胞增殖。利妥昔单抗靶向在大多数B细胞上表达的CD20，但是缺乏仅对自身反应性B细胞的特异性。因此，治疗策略可以引起与一般免疫抑制相关的严重副作用，包括致命感染和继发性癌症。因此，存在对仅靶向自身反应性B细胞的治疗的需要。本专利技术的概述如下所述，本专利技术包括对自身抗体具有特异性的嵌合自身抗体受体(CAAR)的组合物及其使用方法。本专利技术的一方面包括编码嵌合自身抗体受体(CAAR)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括自身抗原的核酸序列或其片段、跨膜结构域的核酸序列、共刺激分子的胞内结构域的核酸序列和信号传导结构域的核酸序列。在另一方面，本专利技术包括载体，该载体包括本文所述的分离的核酸序列。在仍另一方面，本专利技术包括分离的嵌合自身抗体受体(CAAR)，该嵌合自身抗体受体包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在又另一方面，本专利技术包括包含本文所述的CAAR的遗传修饰的细胞。在上述方面或本文描述的本专利技术的任何其他方面的各种实施方式中，自身抗原选自：Dsg1、Dsg3及其片段。在一个实施方式中，自身抗原包括Dsg3，该Dsg3包括选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、和SEQIDNO：36。在另一个实施方式中，自身抗原包括Dsg3，分离的核酸序列还包括编码Dsg3的前肽的核酸序列。在包括Dsg3前肽的一些实施方式中，其包括SEQIDNO：2的氨基酸序列。在另一个实施方式中，分离的核酸序列还包括CD8α链信号肽的核酸序列。在包括CD8α链信号肽的一些实施方式中，其包括SEQIDNO：1的氨基酸序列。在又另一个实施方式中，跨膜结构域的核酸序列编码CD8α链铰链和跨膜结构域。在包括CD8α链铰链和跨膜结构域的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQIDNO：13的氨基酸序列。在仍另一个实施方式中，分离的核酸序列还包括肽接头的核酸序列。在包括肽接头的一些实施方式中，其包括SEQIDNO：14的氨基酸序列。在另一个实施方式中，胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码CD137胞内结构域的核酸序列。在包括CD137胞内结构域的一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括SEQIDNO：15的氨基酸序列。在又另一个实施方式中，胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列。在包括CD3ζ信号传导结构域的一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括SEQIDNO：16的氨基酸序列。在一个实施方式中，包括CAAR的细胞表达它，并且对在B细胞上表达的自身抗体具有高亲和力。在另一个实施方式中，细胞表达CAAR并诱导杀伤表达自身抗体的B细胞。在仍另一个实施方式中，细胞表达CAAR，并且对结合Fc受体的抗体具有低亲和力。在又另一个实施方式中，细胞表达CAAR并且对健康细胞具有有限的毒性。在另一个实施方式中，细胞选自：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、其细胞系和其他效应细胞。在另一个方面，本专利技术包括用于治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，该方法包括：向受试者给予有效量的遗传修饰的T细胞，该T细胞包括编码嵌合自身抗体受体(CAAR)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域，跨膜结构域的核酸序列和胞内信号传导结构域的核酸序列，从而治疗受试者中的自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮和落叶型天疱疮。在上述方面或本文描述的本专利技术的任何其他方面的各种实施方式中，受试者是人。在另一个实施例中，修饰的T细胞靶向B细胞。附图的简要说明当结合附图阅读时，将更好地理解本专利技术的优选实施方式的以下详细描述。为阐明本专利技术，在附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应当理解，本专利技术不限于附图中所示的实施方式的精确安排和手段。图1是描述建议的嵌合自身抗体受体(CAAR)如何区别于所有之前开发的技术的示意图。图2是图示，显示工程化嵌合T细胞受体靶向Dsg3特异性B细胞。图3是图示，显示Dsg特异性记忆B细胞的靶向和去除短寿命抗体分泌B细胞。图4是包括桥粒芯蛋白3(Dsg3)嵌合自身抗体受体(CAAR)的蛋白质结构域的示意图。图5是图像，显示来自外周血单核细胞的cDNA的Dsg3CAAR中使用的单个结构域的扩增。图6是图像，显示来自外周血单核细胞cDNA的Dsg3CAAR中使用的CD137的扩增。图7是一组图像，显示来自质粒DN653的Dsg3CAAR中使用的Dsg3的扩增。图8是图像，显示在还原条件下Dsg3CAAR的蛋白质印迹，以确定在293T细胞的转化和细胞裂解后48小时的蛋白质表达。Dsg3E-His杆状病毒上清液是阳性对照，未转染的HEK293T细胞是阴性对照。未糖基化蛋白的预期大小为96kDa，其通常随着糖基化以约112kD迁移。图9是示意图，描述测试Dsg3CAAR对预期和非预期靶标的特异性的实验。图10是一组流式细胞术图，其显示在暴露于预期靶标后的Dsg3CAAR信号。用抗体包被的珠以3∶1的比例(珠∶细胞)刺激表达Dsg3-CAAR的NFAT-GFPJurkat细胞。AK23、PV4B3和PV2B7是Dsg3特异性mAb，其如果结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码嵌合自身抗体受体(CAAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括自身抗原的核酸序列或其片段，跨膜结构域的核酸序列，共刺激分子的胞内结构域的核酸序列和信号传导结构域的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.02 US 61/987,9891.一种编码嵌合自身抗体受体(CAAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括自身抗原的核酸序列或其片段，跨膜结构域的核酸序列，共刺激分子的胞内结构域的核酸序列和信号传导结构域的核酸序列。2.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述自身抗原选自下组，所述组由以下各项组成：Dsg1、Dsg3及其片段。3.如权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述自身抗原包括Dsg3，所述Dsg3包括选自下组的氨基酸序列，所述组由以下各项组成：SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、和SEQIDNO：36。4.如权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述自身抗原包括Dsg3，并且所述分离的核酸序列还包括编码Dsg3的前肽的核酸序列。5.如权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述Dsg3前肽包括SEQIDNO：2的氨基酸序列。6.如权利要求1所述的分离的核酸序列，还包括CD8α链信号肽的核酸序列。7.如权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述CD8α链信号肽包括SEQIDNO：1的氨基酸序列。8.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述跨膜结构域的核酸序列编码CD8α链铰链和跨膜结构域。9.如权利要求8所述的分离的核酸序列，其中所述CD8α链绞链和跨膜结构域包括SEQIDNO：13的氨基酸序列。10.如权利要求1所述的分离的核酸序列，还包括肽接头的核酸序列。11.如权利要求10所述的分离的核酸序列，其中所述肽接头包括SEQIDNO：14的氨基酸序列。12.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码CD137胞内结构域的核酸序列。13.如权利要求12所述的分离的核酸序列，其中所述CD137胞内结构域包括SEQIDNO：15的氨基酸序列。14.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列。15.如权利要求14所述的分离的核酸序列，其中所述CD3ζ信号传导结构域包括SEQIDNO：16的氨基酸序列。16.一种载体，包括如权利要求1-15中任一项所述的分离的核酸序列。17.如权利要求16所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。18.如权利要求16所述的载体，其中所述载体是RNA载体。19.一种分离的嵌合自身抗体受体(CAAR)，包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域，跨膜结构域和胞内信号传导结构域。20.如权利要求19所述的分离的CAAR，其中所述自身抗原选自下组，所述组由以下各项组成：Dsg1、Dsg3及其片段。21.如权利要求20所述的分离的CAAR，其中所述自身抗原包括Dsg3，所述Dsg3包括选自下组的氨基酸序列，所述组由以下各项组成：SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·S·佩恩，C·T·依尼布莱希特，V·博杰，M·C·米龙，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US