GAL2转运体的变异体和其用途制造技术

本发明专利技术涉及作为Gal2变异体的多肽，其在与T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代和任选地其它氨基酸取代。本发明专利技术另外涉及编码所述多肽的核酸分子并且涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本发明专利技术另外涉及用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子优选地在所述宿主细胞中的表达。本发明专利技术还涉及所述多肽、核酸分子或宿主细胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，和/或用于含有戊糖(优选地D‑木糖和/或L‑阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GAL2转运体的变异体和其用途
本专利技术涉及作为Gal2变异体的多肽，其在与T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代和任选地其它氨基酸取代。本专利技术另外涉及编码所述多肽的核酸分子并且涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本专利技术另外涉及用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子优选地在所述宿主细胞中的表达。本专利技术还涉及所述多肽、核酸分子或宿主细胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，和/或用于含有戊糖(优选地D-木糖和/或L-阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵。
技术介绍
啤酒、葡萄酒和烘焙酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)因其将糖发酵成乙醇和二氧化碳的特征而已用于面包、葡萄酒和啤酒的生产数个世纪。在生物技术中，酿酒酵母除生产异源蛋白质以外，还特别用于生产乙醇用于工业目的。乙醇作为用于合成的初始底物而用于许多工业分支。由于油的存在愈加稀少，油价升高和全世界对石油的需求持续增加，所以乙醇作为一种替代燃料变得愈加重要。此外，酿酒酵母也用于生产其它生物燃料或有价值的生化化合物，如异丁醇、丁二酸、法呢烯/法呢烯或青蒿素。为了使价格实惠并且高效的生物燃料生产成为可能，提出使用含有木质纤维素的生物质本身作为初始底物，如秸秆、来自木材工业和农业的废料以及日常生活垃圾的有机组分。首先，所述生物质是非常方便的，并且其次大量存在。木质纤维素的三种主要组分是木质素、纤维素和半纤维素。半纤维素，在纤维素之后第二种最常出现的聚合物，是一种高度支化的杂聚物。它由戊糖(L-阿拉伯糖、D-木糖)、糖醛酸(4-O-甲基-D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸)和己糖(D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖)组成。虽然半纤维素可以比纤维素更易水解，但是它含有通常无法由酵母酿酒酵母转化的戊糖L-阿拉伯糖和D-木糖。为了能够使用戊糖进行发酵，这些戊糖必须首先穿过质膜进入细胞。虽然酿酒酵母不能代谢D-木糖或L-阿拉伯糖，但是它可以将D-木糖或L-阿拉伯糖吸收至细胞中。然而，酿酒酵母不具有特异性转运体。转运借助于己糖转运体来进行。然而，所述转运体对D-木糖的亲和力明显低于D-葡萄糖(Kotter和Ciriacy,1993)。在如树干毕赤酵母(P.stipitis)、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)或嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)等能够代谢D-木糖的酵母(DuPreez等人,1986)中，转运D-葡萄糖的非特异性低亲和力转运体以及仅针对D-木糖的特异性高亲和力质子同向转运体都存在(Hahn-Hagerdal等人,2001)。在早期实验中，发现一些酵母，如热带假丝酵母(Candidatropicalis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)，天生发酵D-木糖或L-阿拉伯糖或可以至少将其同化。然而，这些酵母完全缺乏将L-阿拉伯糖和D-木糖发酵成乙醇的能力，或它们仅具有极低乙醇产率(Dien等人,1996)。此外，关于D-木糖和L-阿拉伯糖的吸收几乎仍未知晓。在酵母休哈塔假丝酵母中，有人假设质子同向转运(Lucas和Uden,1986)。在酿酒酵母中，由半乳糖通透酶Gal2已知它可以转运D-木糖并且还转运结构与D-半乳糖极其类似的L-阿拉伯糖。(Kou等人,1970)。大部分己糖转运体可以介导D-木糖的吸收。近年来特别结合木糖的发酵描述戊糖在酿酒酵母的经生物技术修饰的酵母菌株中的醇类发酵，其中尤其使用酵母菌株树干毕赤酵母的各种基因进行酿酒酵母的基因修饰。工程改造在此处特别集中于将来自树干毕赤酵母(木糖发酵酵母)的初始木糖同化基因引入到酿酒酵母中，即到传统上用于由己糖生产乙醇的酵母中(Jin等人2004)。Jeppson等人(2006)描述借助于引入与天然利用木糖的酵母树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母中类似或与细菌代谢途径类似的木糖代谢途径而由酿酒酵母发酵木糖。Katahira等人(2006)描述了木质纤维素生物质(如木屑)的硫酸水解产物作为燃料生物乙醇生产的重要材料。在这一研究中，构建能够发酵木糖和纤维寡糖的重组酵母菌株。为此，将多种基因整合到此酵母菌株中，即用于细胞间表达来自树干毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及来自酿酒酵母的木酮糖激酶并且用于在细胞表面上呈现来自棘孢曲霉(Aspergillusacleatus)的β-葡糖苷酶。在木屑的硫酸水解产物发酵中，木糖和纤维寡糖在36小时之后被重组菌株充分发酵。Pitkanen等人(2005)描述了酿酒酵母菌株的木糖恒化分离株的获得和表征，所述分离株过度表达编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母的基因和编码内源性木酮糖激酶的基因。所述分离株是从以木糖作为单个或主要碳源的好氧恒化培养物获得。在好氧条件下在具有30g/l木糖的基本培养基上，恒化分离株的生长速率比原始菌株高3倍(0.15h-1相比于0.05h-1)。木糖吸收率增加几乎两倍。戊糖磷酸代谢途径的关键酶(转酮醇酶、转醛醇酶)的活性增加两倍，而其底物(戊糖-5-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸)的浓度因此降低。Brat等人(2009)筛选核酸数据库关于编码假定的木糖异构酶的序列并且最后能够克隆并在酿酒酵母中成功表达来自厌氧细菌植物发酵梭菌(Clostridiumphytofermentans)的高活性新种类的木糖异构酶。此酶的异源表达赋予酵母细胞代谢D-木糖和使用其作为唯一的碳和能量来源的能力。Demeke等人(2013)研发出一种含有13个基因的表达盒，所述基因包括编码D-木糖异构酶的植物发酵梭菌xylA和戊糖磷酸途径的酶，并且将所述盒插入在工业酿酒酵母菌株EthanolRed基因组的两个复本中。随后进行EMS突变诱发、基因组重排和在D-木糖富集的木质纤维素水解产物中选择，接着在具有D-木糖的复合培养基中进行多轮进化工程改造，逐渐建立非常高效的D-木糖发酵。Becker和Boles(2003)描述了酿酒酵母实验室菌株的工程改造和选择，所述菌株能够使用L-阿拉伯糖进行生长并且使其发酵成乙醇。这可能归因于由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)AraA以及大肠杆菌AraB和AraD组成的细菌L-阿拉伯糖代谢途径的过度表达和同时在酵母菌株中转运L-阿拉伯糖的酵母半乳糖通透酶的过度表达。所选菌株的分子分析显示使用L-阿拉伯糖的预定前提是L-核酮糖激酶的活性较低。然而，尤其报告此酵母菌株生长极慢。Wiedemann和Boles(2008)显示来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的L-阿拉伯糖异构酶和来自大肠杆菌的L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-P4-差向异构酶的密码子优化基因的表达有力地提高L-阿拉伯糖转化率。Farwick等人(2014)研发出一种新的用于筛选和工程改造戊糖转运体的系统，所述戊糖转运体不再受葡萄糖抑制。此系统是基于所有己糖转运体和所有己糖/葡糖激酶缺失的D-木糖发酵酵母菌株(hxt0hxk0菌株)。D-葡萄糖可以不再用作碳源，但是在转运水平下干扰D-木糖利用率。因此，可易于选择允许在浓度增加的D-葡萄糖存在下吸收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其在与SEQ ID NO:1氨基酸序列的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述多肽与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少60％、或优选地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且其中所述多肽具有活体外和/或活体内戊糖转运功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.22 EP 14189927.81.一种多肽，其在与SEQIDNO:1氨基酸序列的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述多肽与SEQIDNO:1氨基酸序列具有至少60％、或优选地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且其中所述多肽具有活体外和/或活体内戊糖转运功能。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal2。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中在与SEQIDNO:1氨基酸序列的T354对应的位置处的所述氨基酸取代是T354A。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的多肽，其在与SEQIDNO:1氨基酸序列的V71对应的位置处包含另一个氨基酸取代，如氨基酸取代V71I。5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的多肽，其中在与T354对应的位置处的所述氨基酸取代与无这类氨基酸取代的多肽相比增加所述活体外和/或活体内戊糖转运功能的活性。6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的多肽，其中在与T354对应的位置处的所述氨基酸取代与无这类氨基酸取代的多肽相比增加所述多肽对戊糖的亲和力。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的多肽，其中所述戊糖是D-木糖和/或L-阿拉伯糖。8.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至7中任一权利要求所述的多肽。9.根据权利要求8所述的核酸分子，其另外包含载体核酸序列，优选地表达载体序列；和/或包含启动子核酸序列和终止子核酸序列；和/或包含其它调控核酸序列和/或其中所述核酸分子包含dsDNA、ssDNA、PNA、CNA、RNA或mRNA或其组合。10.一种宿主细胞，其含有根据权利要求8或9中任一权利要求所述的核酸分子并且优选地表达所述核酸分子，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃克哈德·博尔思，海克·迪茨，亚历山大·法尔维克，维吉尼亚·夏德维格，米斯拉夫·欧雷布，
申请(专利权)人：布塔尔格有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH