信号约束测序（SCS）和用于信号约束测序的核苷酸类似物制造技术

本发明专利技术提供了荧光核苷酸类似物。本发明专利技术还提供了在合成测序中使用核苷酸类似物的方法和信号约束方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】信号约束测序(SCS)和用于信号约束测序的核苷酸类似物相关申请的交叉引用本申请要求2014年10月23日提交的美国临时申请62/067,952的优先权益。该优先权申请的全部内容并入本文以用于所有目的。
本文公开了核苷酸类似物，在合成测序(sequencing-by-synthesis:SBS)中使用核苷酸类似物的方法和信号约束方法。
技术介绍
用于给DNA和RNA测序的一些方法会遭遇：在碱添加中不准确，向DNA模板引入疤痕，以及由于在反应中存在染料而导致不可接受的高背景噪音，从而削弱染料信号。需要用于对DNA和RNA测序的有效方法。
技术实现思路
本文描述了具有以下化学式的核苷酸类似物：其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；L不存在或者是连接基团；R1是核苷碱基；R2是氢或保护基团(blockinggroup)；B是结合分子；X是检测标记。在一些实施方案中，R2是保护基团，并且保护基团是-NH2、-CH2CH＝CH2、-CH2N3、聚乙二醇或经取代或未经取代的烷基。在一些实施方案中，L是连接基团，并且连接基团是经取代或未经取代的烷基，经取代或未经取代的烯基或经取代或未经取代的芳基。任选地，连接基团是亚甲基或经取代的苯基。连接基团可进一步包括猝灭剂。任选地，结合分子是生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素或肽。任选地，检测标记是含有阳离子基团的分子、含有阴离子基团的分子、荧光(fluorescent)分子(例如荧光染料)、荧光性分子(afluorogenicmolecule)、金属、还原标记、含硫分子或经取代的或未经取代的烷基。本文还描述了用于为靶核酸测序并约束信号的方法。用于为靶核酸测序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物：其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；L不存在或者是连接基团；R1是核苷碱基；R2是氢或保护基团；B是结合分子；X是检测标记，其中所述检测标记被猝灭。该方法还包括：通过并入核苷酸类似物来延伸引物；提供磷酸酶以在结合分子和连接基团之间或在结合分子和末端磷酸酯之间进行切割，从而产生核苷酸类似物的包含标记和结合分子的片段，其中标记是未被猝灭的；将片段与固定在表面上的捕获元件结合；以及检测来自被捕获在表面上的片段的标记的荧光发射。在一些实施方案中，结合分子包含寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获元件是含硫或含硫醇的分子。在一些实施方案中，捕获元件是链霉亲和素、抗体、蛋白质或树枝状聚合物。在一些实施方案中，捕获元件包含与模板核酸互补的固定的寡核苷酸。在一些实施方案中，模板核酸是包含互补捕获序列的多个拷贝的固定化DNA连环体。在一些实施方案中，连接基团还包含猝灭剂。任选地，提供步骤可以包括从连接基团置换猝灭剂。在一些实施方案中，该方法还可以包括从固体表面上的捕获元件去除片段。任选地，去除步骤包括加热片断和捕获元件。任选地，去除步骤包括用缓冲液洗涤片断和捕获元件。任选地，去除步骤包括添加酶以将片段从捕获元件切割开。该方法还可以包括将保护基团从并入的核苷酸类似物切割开。在一些实施方案中，使用荧光共振能量转移来执行检测步骤。本文进一步描述的是测序方法。测序方法包括：组合模板核酸、与模板互补的引物、包含含氮碱基和可检测标记的核苷酸类似物和聚合酶；在使得在引物延伸反应中所述引物延伸的条件下维持在组合步骤中的组分以产生互补多核苷酸，其中所述含氮碱基通过所述聚合酶并入所述互补多核苷酸，并且所述可检测标记通过聚合酶与所述含氮碱基分离，并且未并入所述互补多核苷酸中，并且其中分离的所述可检测标记被捕获元件结合；以及检测由捕获元件结合的可检测标记，其中所述检测提供序列信息。一个或多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。其他特征、目的和优点将根据说明书和附图以及权利要求书变得显而易见。附图说明图1A-D显示了使用核苷酸类似物的合成测序的方法的步骤。图1E是图1A-D的插图。图2显示了描述核苷酸类似物转化为荧光分子的方案。图3显示了含有固定化DNA连环体并包含互补捕获序列的多个拷贝的液滴卡通图。图4是显示使用核苷酸类似物的合成测序方法，其中荧光片段通过瞬时二溴马来酰亚胺接头连接到阵列的表面。图5是显示使用含有生物素作为结合分子的核苷酸类似物的合成测序方法的方案。该方案中的捕获元件与引物的5'末端结合。图6是显示使用含有生物素作为结合分子的核苷酸类似物的合成测序方法的方案。该方案中的捕获元件与寡核苷酸在引物的5'末端结合。图7是显示合成测序方法的方案，其中通过杂交进行表面捕获。图8是显示合成测序方法的方案，其中核苷酸类似物含有猝灭剂并通过杂交进行表面捕获。图9A和9B包含合成测序方案，其中通过含链霉亲和素的捕获元件进行表面捕获。图10包含合成测序方案，其中通过单色系统中的诱导物进行表面捕获。图11包含合成测序方案，其中通过含硼酸盐猝灭剂的捕获元件进行表面捕获。图12包含合成测序方案，其中通过含链霉亲和素的捕获元件进行表面捕获。图13包含合成测序方案，其中通过双色系统中的诱导物进行表面捕获。图14A-E示出了使用核苷酸类似物的合成测序方法的步骤。定义本文所用的术语“可检测标记”或“检测标记”是指可用于提供可检测和/或可量化信号的任何原子或分子。合适的标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。在一些实施方案中，检测标记是含有带电基团的分子(例如，含有阳离子基团的分子或含有阴离子基团的分子)、荧光分子(例如荧光染料)、荧光性(fluorogenic)分子或金属。任选地，检测标记是荧光性标记。荧光性标记可以是任何能够在处于非猝灭形式时发出光的标记(例如，当不被另一种试剂猝灭时)。当被合适的激发波长激发时，荧光部分以特定的发射波长发射光能(即发荧光)。当荧光部分和猝灭剂部分非常接近时，由荧光部分发射的光能被猝灭剂部分吸收。任选地，检测标记是荧光染料。在一些实施方案中，荧光染料是荧光素、罗丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些实施方案中，荧光性染料是羧基荧光素。合适的荧光性染料的其他示例包括在ALEXAFLUOR产品系(LifeTechnologies；Carlsbad，CA)下可商购的荧光性染料。任选地，标记是氧化还原标记。任选地，标记是还原标签，含硫分子或经取代或未经取代的烷基。术语“染料”在本
具有其标准含义。本文所用的术语“荧光染料”通常是指当通过电磁辐射源(例如灯、光电二极管或激光)照射时，通过荧光机构发射较长波长的电磁辐射的任何染料。术语“报道分子”是指能够产生荧光信号的分子。报道分子是可检测标记的示例。“猝灭剂分子”是指能够吸收受激报道分子的荧光能从而猝灭否则将从受激报道分子释放的荧光信号的分子。为了使猝灭剂分子猝灭受激的荧光团，通常有利的是猝灭剂分子在从报道分子的激发开始但在报道分子释放所存储的荧光能量之前的某个时间处于受激报道分子的最小猝灭距离之内。在基于邻近的猝灭应用中，报道分子和猝灭剂分子彼此充分接近，使得每当报道分子被激发时，受激态的能量转移到猝灭剂分子，其中其被非辐射地散发或以与报道分子的发射频率不同的发射频率发射。几个非辐射能量传递机构在较短距离上工作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下述化学式的核苷酸类似物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.23 US 62/067,9521.一种具有下述化学式的核苷酸类似物：其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；L不存在或为连接基团；R1是核苷碱基；R2是氢或保护基团；B是结合分子；并且X是检测标记。2.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中R2是保护基团，并且所述保护基团选自–NH2、-CH2CH＝CH2、–CH2N3、聚乙二醇和经取代或未经取代的烷基。3.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中L是连接基团，并且所述连接基团选自经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基或经取代或未经取代的芳基。4.根据权利要求3所述的核苷酸类似物，其中所述连接基团是亚甲基。5.根据权利要求3所述的核苷酸类似物，其中所述连接基团是经取代的苯基。6.根据权利要求3所述的核苷酸类似物，其中所述连接基团还包含猝灭剂。7.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述结合分子选自生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素和肽。8.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述检测标记选自：含有阳离子基团的分子、含有阴离子基团的分子、荧光分子(例如荧光染料)、荧光性分子、金属、还原标签、含硫分子和经取代或未经取代的烷基。9.一种用于靶核酸测序的方法，其包括：a)提供固定在表面上的模板核酸、引物、聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物：其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；L不存在或是连接基团；R1是核苷碱基；R2是氢或保护基团；B是结合分子；并且X是检测标记，其中所述检测标记被猝灭；b)通过并入所述核苷酸类似物延伸所述引物；c)提供磷酸酶以在所述结合分子和所述连接基团之间或在所述结合分子和末端磷酸酯之间进行切割，从而产生(I)的包含所述标记和所述结合分子的片段，其中所述标记是未被猝灭的；d)将所述片段与固定在表面上的捕获元件结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯尼泽纳·德尔马纳茨，李涵东，拉多吉·德尔马纳茨，埃里克·哈尼斯，徐崇军，
申请(专利权)人：考利达基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US