一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置和方法，芯片由PDMS和石英两层组成，将微流控芯片技术与液滴生成技术、荧光抗体制备技术以及荧光检测技术结合，实现单细胞内蛋白的高通量定量检测，为细胞生物特性的表征提供可靠的装置和方法。通过设计制作荧光抗体对及设置滤光片，可以有效地提高检测精度，减小检测误差。使用的倒置荧光显微镜、光电倍增管等设备，可以在传统的生物实验室使用，适应性强，可移植性高，便于实现。

【技术实现步骤摘要】
一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置和方法
本专利技术涉及检测
，尤其涉及一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置和方法。
技术介绍
蛋白质作为生命体的主要组成成分，主导或参与了几乎所有的生物活动与生物学功能。蛋白质的数量与活性，是反映生命活动变化的最主要指标，与细胞的分化、神经的传导等紧密关联。因此，多种蛋白质分析方法诸如凝胶电泳、免疫分析、色谱与质谱等，被发展应用于细胞过程分子机制的研究、疫苗与药物等。然而这些方法是针对宏观大量蛋白质而发展起来的，需要足够数量的细胞来分析，其最终结果是细胞群体水平的平均结果，这会掩盖潜在的反应过程，使我们错失很多细胞过程中关键分子机制，如胚胎发育的细胞定向分化等。而单细胞水平测得数据的数据更能够反映生命事件的真实情况，具有重要的科学价值。因此，研制高通量单细胞蛋白定量检测分析仪器，在病原生物学、免疫学、血液诊断与干细胞生物学等重大科学研究领域有着迫切的需求。目前可以定量检测单细胞蛋白的方法主要是流式细胞术和基于微流控技术的蛋白检测方法。流式细胞术(flowcytometry)是单细胞蛋白分析的主要手段，其原理是通过荧光标记待测蛋白实现单个细胞多参数、快速的定量分析，通过表面荧光分子浓度可控的校准微球可以得到标准曲线，对比标准曲线可以得到蛋白浓度。微流控技术是指在微观尺寸下控制和检测流体的技术，由于特征尺寸与细胞尺寸相匹配，适合单细胞操纵与特性检测。目前微流控技术与单细胞蛋白分析的结合尚处于起步阶段，现有的检测方法主要有微型流式细胞术、微孔序列、微沟道序列和单细胞蛋白质印迹法。在实现本专利技术的过程中，申请人发现上述现有技术存在如下技术缺陷：流式细胞仪中使用的校准微球只能对细胞膜蛋白进行定量，而在校准微球内部进行荧光分子定量修饰的方法尚不成熟，无法使用传统校准微球方法进行单个细胞内蛋白表达的定量检测。现有的基于微流控技术的单细胞蛋白检测方法存在通量低，不能检测胞浆蛋白等问题。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的主要目的是提供一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置以及方法。(二)技术方案本专利技术提供了一种微流控芯片，包括衬底、以及所述衬底上的有机硅材料层，所述衬底和有机硅材料层形成有沟道，所述沟道通入细胞悬液、细胞裂解液、荧光抗体以及油相混合液；所述衬底上还形成有一窗口，在所述沟道中产生包裹有单细胞的油包水型液滴，所述油包水型液滴中的细胞被细胞裂解液裂解，细胞中的蛋白与荧光抗体结合，形成的荧光液滴经过窗口时被检测。优选地，所述衬底为石英衬底，所述有机硅材料层为聚二甲基硅氧烷层。本专利技术还提供了一种单细胞蛋白定量检测装置，包括上述微流控芯片，还包括：压力控制模块、荧光检测模块和中央控制模块；所述压力控制模块对沟道进行流速调节；所述荧光检测模块包括：激光激发组件和荧光采集组件；所述激光激发组件向微流控芯片的窗口发射激光，使沟道内的荧光抗体受激发光；荧光采集组件采集荧光液滴的荧光亮度数据；所述中央控制模块，向压力控制模块和荧光检测模块发送控制信号，并接收荧光检测模块采集的荧光亮度数据，进行数据的处理与分析，得到液滴大小数据，并对比标准曲线得到单细胞内蛋白数量。本专利技术还提供了一种微流控芯片的制备方法，用于制备上述微流控芯片，包括：步骤A：制作SU-85种子层；步骤B：制作SU-825细胞通道层；步骤C：PDMS的浇注、翻模，制得PDMS器件；步骤D：在石英衬底上溅射铬；步骤E：在溅射有铬的石英衬底上制作AZ1500掩膜；步骤F：进行腐蚀处理，形成带有铬窗口的石英衬底；步骤G：PDMS器件与石英衬底的键合，制成微流控芯片。本专利技术还提供了一种单细胞蛋白定量检测方法，使用上述单细胞蛋白定量检测装置检测单细胞蛋白数量，包括：步骤S1：制备荧光抗体；步骤S2：注入油相及水相形成包裹有细胞的液滴，细胞裂解后形成荧光液滴；步骤S3：采集荧光亮度数据；步骤S4：处理荧光亮度数据得到单细胞蛋白数量。优选地，所述步骤S1制备的荧光抗体为可识别蛋白不同表位的荧光抗体对，其两个抗体分别连接荧光基团A和荧光基团B，荧光集团A为HiLyteFluorTM555，吸收光波峰/发射光波峰＝550/566nm，荧光集团B为HiLyteFluorTM647，吸收光波峰/发射光波峰＝649/674nm；荧光集团A的发射光特征谱线与荧光集团B的吸收光特征谱线重叠，且当两个抗体与蛋白结合后，荧光集团A和荧光集团B相距10nm以内，发生非放射性的能量转移。优选地，所述步骤S2包括：将微流控芯片装载于单细胞蛋白定量检测装置；向微流控芯片的沟道通入细胞悬液、细胞裂解液和荧光抗体、以及矿物油和表面活性剂的油相混合液；细胞悬液、细胞裂解液和荧光抗体形成水相混合液，水相混合液在油相混合液的夹流下形成油包水型液滴，且每个油包水型液滴中包含不多于一个细胞，细胞裂解液将细胞裂解，荧光抗体与细胞中的单笔结合形成荧光液滴，荧光液滴接着进入微流控芯片的窗口。优选地，所述步骤S3包括：所述荧光液滴逐一通过窗口时，激光激发组件发射的激光经窗口激发荧光基团A发光，荧光采集组件检测荧光基团B的荧光亮度数据。优选地，所述步骤S3还包括：绘制标准曲线，包括：制备一组浓度已知的待测细胞蛋白；将各个浓度的待测细胞蛋白与荧光抗体形成一组乳化液滴，并采集各个乳化液滴的荧光亮度数据，绘制出表示蛋白浓度与荧光亮度关系的标准曲线。优选地，所述步骤S4包括：计算荧光液滴的长度；设置荧光亮度阈值，将荧光亮度高于所述阈值的荧光液滴作为对象液滴；对照标准曲线中的荧光亮度与蛋白浓度的关系，由对象液滴的荧光亮度值得到对象液滴的蛋白浓度；由对象液滴的蛋白浓度和长度得到单细胞蛋白数量。(三)有益效果从上述技术方案可以看出，本专利技术的微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置以及方法有以下有益效果：(1)本专利技术将微流控芯片技术与液滴生成技术、荧光抗体制备技术以及荧光检测技术结合，实现单细胞内蛋白的高通量定量检测，为细胞生物特性的表征提供可靠的装置和方法。(2)通过设计制作荧光抗体对及设置滤光片，可以有效地防止激发光给检测结果带来的影响，提高了检测精度，减小了检测误差。(3)使用的倒置荧光显微镜、光电倍增管等设备，可以在传统的生物实验室使用，适应性强，可移植性高，便于实现。(4)选取石英和聚二甲基硅氧烷等材料，基于微细加工方法进行制备，具有可批量化制造、一次性等特点。附图说明图1a和图1b为本专利技术实施例的微流控芯片的结构示意图和剖面图；图2为本专利技术实施例的单细胞蛋白定量检测装置的结构示意图；图3为本专利技术实施例的微流控芯片的制备方法流程图；图4A至J为图3所述制备方法各步骤对应的芯片结构图；图5为本专利技术实施例的单细胞蛋白定量检测方法的流程图；图6为荧光液体在金属窗口中的时间与荧光亮度关系图。符号说明1-石英衬底；2-聚二甲基硅氧烷层；3-金属窗口；4-中央水平沟道；5-垂直沟道；6-侧沟道。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。本专利技术将微流控芯片技术与液滴生成技术、荧光抗体制备技术以及荧光检测技术结合，提出一种微流控芯片、单细胞蛋白定量检测装置以及方法。本专利技术实现单个细胞的乳化液滴包裹，细胞裂解，细胞骨架蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于，包括衬底、以及所述衬底上的有机硅材料层，所述衬底和有机硅材料层形成有沟道，所述沟道通入细胞悬液、细胞裂解液、荧光抗体以及油相混合液；所述衬底上还形成有一窗口，在所述沟道中产生包裹有单细胞的油包水型液滴，所述油包水型液滴中的细胞被细胞裂解液裂解，细胞中的蛋白与荧光抗体结合，形成的荧光液滴经过窗口时被检测。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于，包括衬底、以及所述衬底上的有机硅材料层，所述衬底和有机硅材料层形成有沟道，所述沟道通入细胞悬液、细胞裂解液、荧光抗体以及油相混合液；所述衬底上还形成有一窗口，在所述沟道中产生包裹有单细胞的油包水型液滴，所述油包水型液滴中的细胞被细胞裂解液裂解，细胞中的蛋白与荧光抗体结合，形成的荧光液滴经过窗口时被检测。2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述衬底为石英衬底，所述有机硅材料层为聚二甲基硅氧烷层。3.一种单细胞蛋白定量检测装置，其特征在于，包括权利要求1所述的微流控芯片，还包括：压力控制模块、荧光检测模块和中央控制模块；所述压力控制模块对沟道进行流速调节；所述荧光检测模块包括：激光激发组件和荧光采集组件；所述激光激发组件向微流控芯片的窗口发射激光，使沟道内的荧光抗体受激发光；荧光采集组件采集荧光液滴的荧光亮度数据；所述中央控制模块，向压力控制模块和荧光检测模块发送控制信号，并接收荧光检测模块采集的荧光亮度数据，进行数据的处理与分析，得到液滴大小数据，并对比标准曲线得到单细胞内蛋白数量。4.一种微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求1所述的微流控芯片，包括：步骤A：制作SU-85种子层；步骤B：制作SU-825细胞通道层；步骤C：PDMS的浇注、翻模，制得PDMS器件；步骤D：在石英衬底上溅射铬；步骤E：在溅射有铬的石英衬底上制作AZ1500掩膜；步骤F：进行腐蚀处理，形成带有铬窗口的石英衬底；步骤G：PDMS器件与石英衬底的键合，制成微流控芯片。5.一种单细胞蛋白定量检测方法，其特征在于，使用权利要求3所述的单细胞蛋白定量检测装置检测单细胞蛋白数量，包括：步骤S1：制备荧光抗体；步骤S2：注入油相及水相形成包裹有细胞的液滴，细胞裂解后形成荧光液滴；步骤S3：采集荧光亮度数据；步骤S4：处理荧光亮度数据得到单细胞蛋白数量。6.如权利要求5所述的单细胞蛋白定量检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健，范蓓媛，李秀锋，闫冬，曹姗姗，岳文涛，赵晓婷，陈德勇，王军波，
申请(专利权)人：中国科学院电子学研究所，中国科学院武汉病毒研究所，首都医科大学附属北京胸科医院，
类型：发明
国别省市：北京,11