利用报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法技术

本发明专利技术公开了以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。

【技术实现步骤摘要】
利用报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及基因工程和基因分析，具体涉及一种利用报告基因选择性富集突变核酸片段的方法。
技术介绍
肿瘤是一种病因尚未完全阐明的疾病，主要有基因突变所导致。因此，筛选肿瘤高危人群以及进行早期诊断和治疗尤为重要。近年来，随着免疫学，生物化学，分子生物学及相应技术的发展，肿瘤生物学标志物的研究也得到了深化和突破，尤其是肿瘤循环DNA的发现，为肿瘤早期诊断的无创性和敏感性带来了契机。并使循环DNA成为肿瘤早期诊断研究的新靶点。自杀基因(suicidegene)，是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。自杀基因若能正常表达，其携带的基因表达的蛋白质便能杀死宿主细胞，若自杀基因那段序列不能正常编码即移码或含有终止密码子，便不能正常表达自杀基因，宿主细胞便能正常生长。利用热点突变如KRAS12位点突变，突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长。自杀基因具有敏感性高，假阳性等优点，从而用于检测循环DNA。循环DNA是存在于外周血中的有利于细胞外的核酸。目前检测循环DNA的方法有Sanger一代测序和高通量测序及数字PCR等，Sanger一代测序敏感性不到百分之十，高通量测序及数字PCR等敏感性最大可达到千分之一，但可能存在假阳性且现有千分之一的敏感性仍不足以对肿瘤进行早期诊断。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题在于提供一种利用自杀报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法，通过选择性破坏抑制含有一种特定基因型片段相关载体的扩增而不会抑制另外基因型片断相关载体的扩增，达到将特定基因型片段进行富集的目的。本专利技术的第一方面提供的技术方案：以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。从而为测序提供一种已经对突变基因进行了富集的待测标本，以提高测序分析的敏感性。本专利技术优选的技术方案中，以含有自杀基因的质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，优选以含自杀基因pDONER211质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段。且自杀基因的序列为SeqIDNo.1所示。本专利技术优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的野生型基因片段不含有终止密码子，而突变型基因片段含有终止密码突变或含有可转化为终止密码子的突变，即突变型基因片段在克隆进自杀载体后始终表现出含有终止密码子的作用而使自杀基因丧失自杀作用。本专利技术优选的技术方案中，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp；更优选地，所述野生型基因片段或突变型基因片段为20-100bp；进一步，所述野生型基因片段或突变型基因片段优选为10-50bp。本专利技术优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段为点突变或移码突变。优选地，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子；更优选地，所述野生型基因片段为20-100bp，且不含终止密码子；进一步所述野生型基因片段优选为10-50bp，且不含终止密码子。本专利技术的第二方面提供自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，其特征在于，其包括如下步骤：(1)评估核酸样本情况，(2)提供含有自杀基因作为报告基因的质粒载体，(3)将步骤(1)中的核酸样本连接到步骤(2)中的含有自杀基因作为报告基因的质粒载体中，(4)将步骤(3)中的质粒载体转化H5a感受态细胞，在含有抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，(5)挑取筛选培养基上的菌落，测序验证。本专利技术优选的技术方案中，所述步骤(1)中核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子时，评估适于本方法进行后续操作。本专利技术优选的技术方案中，所述步骤(2)中为含有自杀基因的质粒载体，所述步骤(3)中将核酸样本连接到含有自杀基因的质粒载体中；优选地为pDONER211质粒载体。本专利技术优选的技术方案中，核酸样本构建的两侧酶切位点可以包括但不限为：AARI，HindIII或KpnI酶切位点。优选地,步骤(3)中将核酸样本连接到pDONER211质粒载体的多克隆位点中。本专利技术优选的技术方案中，自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，其特征在于，其包括如下步骤：(A)评估核酸样本情况，(B)提供含有自杀基因的质粒，(C)以含有自杀基因的质粒为载体，将PCR扩增的待测标本片段克隆到含有自杀基因的的载体中，(D)将步骤(C)中的质粒载体转化H5a感受态细胞，在含有Kana霉素抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，(E)挑取筛选培养基上的菌落，PCR或者测序验证。优选地，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的突变为点突变；若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长；优选为KRAS12位点突变，其突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。优选地，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的突变为移码突变；具体而言当突变核酸片段为3的整数倍3n时，由于片段的碱基数目的是3的整数倍，不产生移码，含有该型质粒的菌落无法在培养基上生长；当突变核酸的片段不是3的整数倍，如为3n+1或者含有终止密码子，含有该型质粒的菌落就可以在培养基上生长。大肠杆菌DB3.1细胞含有gyrA462基因，对λ嗜菌体的ccdB基因产物的毒性具有抵抗作用，特别适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107cfu/μgDNA.，－70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。质量稳定，使用方便，质优价廉。DB3.13菌株的基因型为：F-gyrA462endA1Δ(sr1-recA)mcrBmrrhsdS20(rB-,mB-)supE44ara-14galK2lacY1proA2rpsL20(SmR)xyl-5λ-leumtl1抗生素耐药性：DB3.13感受态细胞具有链霉素抗性。操作步骤(以下操作均按无菌条件的标准进行)：提示DB3.1感受态细胞应保存在－70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。本专利技术中，自杀基因被选作为报告基因，因为它同时满足了上述用于检测基因突变的报告基因的两个要求,对突变有极高耐受性，假阳性极少。如果插入片段的碱基数目的是三的整数倍，不产生移码，该型质粒就不能在普通的感受态细胞上生长。如果插入的片段不是三的整数倍或者含有终止密码子，该型质粒就可以在普通的大肠杆菌感受态细胞生长。通过长菌数目的比例，从而判断出是野生还是突变，最后应用于kras热点突变的12位突变点，突变之本文档来自技高网...

【技术保护点】
以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。

【技术特征摘要】
1.以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以含有自杀基因的质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸样本中含等位基因的野生型基因片段含有可转化为终止密码子的序列。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段为点突变或移码突变。6.自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)评估核酸样本情况，(2)提供含有自杀基因作为报告基因的质粒载体，(3)将步骤(1)中的核酸样本连接到步骤(2)中的含有自杀基因作为报告基因的质粒载体中，(4)将步骤(3)中的质粒载体转化感受态细胞，在含有抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，(5)挑取筛选培养基上的菌落，测序验证。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢光明，王凤娇，刘璇，肖莉，张佳，李凯，
申请(专利权)人：苏州佳章生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32