一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和植物转基因技术领域，具体涉及一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它采用如下的方法步骤：步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个及一个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；它利用多元sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术定向编辑木薯基因组中SBEI或者SBEII基因序列，可以显著改变薯类植物的淀粉组成和性状，具有能提高薯类植物淀粉中直链淀粉含量；降低薯类植物淀粉中支链淀粉；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；并且通过杂交或者自交可获得不含外源基因片段的新品系，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用
本专利技术涉及生物技术和植物转基因
，具体涉及一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用。
技术介绍
薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。淀粉作为重要的粮食和工业原材料在国民生产中具有重要的意义。淀粉的组成包含直链淀粉和支链淀粉两大部分。直链淀粉是D-葡萄糖基以α-(1,4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，分子量1～2×105，聚合度990，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。支链淀粉分子中除有α-(1，4)糖苷键的糖链外，还有α-(1，6)糖苷键连接的分支，分子中含300～400个葡萄糖基，分子量>2×107，聚合度7200，各分支也都是卷曲成螺旋形。不同直链淀粉含量的淀粉在工业运用和食品加工中具有极大地差异。因此，研究薯类植物淀粉的组成和性质，找到调节储藏根性状的关键性因素，是本领域研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用。本专利技术所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它采用如下的方法步骤：步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个、两个及两个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；步骤三：步骤二中的所述的CRISPR/Cas9多元系统的sgRNA核苷酸序列选自下组：(a)如SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3核苷酸序列中的核酸序列；(b)将SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3核苷酸序序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；(c)或者与(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；步骤四：步骤一中所述的对SBEI或者SBEII基因的编辑包括如下方面：(a)对SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑或对包含SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑(b)对(a)中所述编辑包括：单个或多个核酸位点的取代、缺失或添加；步骤五：终止植物中SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成，从而提高薯类植物储藏根中直链淀粉含量，降低支链淀粉的含量；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；步骤六：从终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物，包括：直接产生的较调节前而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的有外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的无外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；进一步地，所述薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜或雪莲果。进一步地，编辑所述SBEI或者SBEII核苷酸序列的sgRNA靶向SBEI或者SBEII基因组核苷酸序列；较佳地，靶向SBEI基因组的第1939-1958位和2948-2967位；或者SBEII基因组序列的1-20位和1193-1212位。采用上述结构后，本专利技术有益效果为：本专利技术所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它利用多元sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术定向编辑木薯基因组中SBEI或者SBEII基因序列，可以显著改变薯类植物的淀粉组成和性状，具有能提高薯类植物淀粉中直链淀粉含量；降低薯类植物淀粉中支链淀粉；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；并且通过杂交或者自交可获得不含外源基因片段的新品系，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。【附图说明】此处所说明的附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，但并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：图1是sgRNA在SBEI或者SBEII基因组序列中位置示意图。图2是CRISPR/Cas9系统多元载体示意图。图3是转基因植株Southernblot鉴定。图4是CRISPR/Cas9转基因植株PCR检测结果。图5是双元CRISR/Cas9基因编辑效果检测。图6是用多元sgRNA介导的CRISR-Cas9技术改造木薯后直链淀粉含量。【具体实施方式】下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，其中的示意性实施例以及说明仅用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。本专利技术中，对各附图进行具体陈述，如下：图1是sgRNA在SBEI或者SBEII基因组序列中位置示意图。灰色方框区为外显子区，黑色线区是内含子区。图2是CRISPR/Cas9系统多元载体示意图。其中sgRNA-cas9是中间过渡载体；pCAMBIA1301S为终表达载体。sgRNA1、sgRNA2利用拟南芥U6启动子启动；Cas9基因由拟南芥uBQ启动子启动，带有flag标签。终载体中带有潮霉素抗性基因：hygII，以CaMV35S启动子启动。图3是转基因植株Southernblot鉴定。Mark：λ-HindIIIMarker，基因组DNA通过HindIII酶切，琼脂糖胶分离、转膜后用潮霉素探针杂交，红色字体为单拷贝植株。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片。SBEI-Cas9是SBEI转基因植株结果；SBEII-Cas9是SBEII转基因植株结果图4是CRISPR/Cas9转基因植株PCR检测结果。M:DL2000plusmarker；WT:野生型对照组；L系列：转基因系列株系。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片，PCR扩增后琼脂糖胶凝胶电泳分离，为待选株系。图5是双元CRISR/Cas9基因编辑效果检测。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片，PCR扩增后琼脂糖胶凝胶电泳分离，测序；A:MeGBSSISBEI-sg-1表示PCR产物中大片段测序结果中MeGBSSISBEI-cas9双元体系中sgRNA1位点的基因编辑结果；MeGBSSISBEI-sg-2表示MeGBSSISBEI-cas9双元体系中sgRNA2位点的基因编辑结果。MeSBEI-sg-out或者SBEII-sg-out表示PCR中小片段的测序结果，即敲除目的基因后测序结果。“--”表示核酸被删除；灰色为原始序列。MeSBEII与MeSBEI相同；图6、用多元sgRNA介导的CRISR-Cas9技术改造木薯后直链淀粉含量。取种植室外大田生长六个月的野生型和转基因植株，提取淀粉，测定直链淀粉和支链淀粉含量。WT:野生型木薯淀粉；MeSI系列：多元sgRNA介导的CRISR-Cas9系统编辑MeSBEI后的转基因植株。MeSII系列:多元sgRNA介导的CRISR-Cas9系统编辑MeSBEII后的转基因植株。如本文档来自技高网...

【技术保护点】
提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，其特征在于：它采用如下的方法步骤：步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个、两个及两个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；步骤三：步骤二中的所述的CRISPR/Cas9多元系统的sgRNA核苷酸序列选自下组：(a)如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序列中的核酸序列；(b)将SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；(c)或者与(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；步骤四：步骤一中所述的对SBEI或者SBEII基因的编辑包括如下方面：(a)对SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑或对包含SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑；(b)对(a)中所述编辑包括：单个或多个核酸位点的取代、缺失或添加；步骤五：终止植物中SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成，从而提高薯类植物储藏根中直链淀粉含量，降低支链淀粉的含量；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；步骤六：从终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物，包括：直接产生的较调节前而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的有外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的无外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物。...

【技术特征摘要】
1.提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，其特征在于：它采用如下的方法步骤：步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个、两个及两个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；步骤三：步骤二中的所述的CRISPR/Cas9多元系统的sgRNA核苷酸序列选自下组：(a)如SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3核苷酸序列中的核酸序列；(b)将SEQIDNO：1或者SEQIDNO：3核苷酸序序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；(c)或者与(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；步骤四：步骤一中所述的对SBEI或者SBEII基因的编辑包括如下方面：(a)对SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑或对包含SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑；(b)对(a)中所述编辑包括：单个或多个核酸位点的取代、缺失或添加；步骤五：终止植物中SBE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，吴银亮，周文智，
申请(专利权)人：江苏三黍生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32