一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种包含来源于人胱硫醚β‑合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列，其序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，包含来源于人胱硫醚β‑合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列作为可视化蛋白表达融合标签的用途；一种融合表达载体，是将六个组氨酸、包含人胱硫醚β‑合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列和凝血酶酶切位点基因克隆至大肠杆菌表达载体而获得，一种可视化融合蛋白表达系统，至少包括上述的融合表达载体；能解决通过肉眼观察重组蛋白在表达及纯化过程中变化的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用
本专利技术属于蛋白质表达纯化
，具体涉及一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用。
技术介绍
重组蛋白表达技术现已广泛应用于生物学各个领域。将外源基因转入大肠杆菌、酵母菌等宿主细胞中进行表达以获得目的蛋白，是科学研究以及生产过程中获取所需蛋白质的重要方法。然而，许多外源蛋白的可溶性表达量很低或者形成不具有活性包涵体。目前，有许多方法可以提高重组蛋白的可溶性表达，其中将目的蛋白和标签蛋白融合表达是提高目的蛋白可溶性的有效手段。标签蛋白是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。大量实践证明，合理使用标签蛋白可增加目标蛋白的表达量，促进目标蛋白的正确折叠。而一些亲和标签，如谷胱甘肽S-转移酶(GSTtag)、组氨酸标签(Histag)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等，还可用于蛋白的纯化(CurrOpinBiotechnol.2006,17(4):353-358)。但是目前使用的融合标签种类还不足，由于蛋白质结构和性质的多样性，没有一种通用的融合标签能解决提高所有的异源蛋白的表达可溶性问题，也没有一种融合标签可以用于纯化所有的蛋白，因此开发新型的标签蛋白对异源蛋白的可溶性表达及纯化具有重要意义。除了重组蛋白的可溶性表达问题，另一个制约重组蛋白表达技术的是蛋白质的纯化。尽管目前组氨酸标签(Histag)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTtag)和麦芽糖结合蛋白(MBP)等多种标签已经广泛用于重组蛋白的亲和层析纯化。但是这些标签蛋白在可见光下均为无色，无法实现重组蛋白在表达及纯化过程中的持续可视化跟踪。如果借助融合蛋白标签能实现重组蛋白表达过程及其纯化过程的肉眼可视化，不仅能够提高蛋白表达条件优化的效率，而且在后续纯化中能实时监测蛋白纯化效率及纯度。例如，可以通过肉眼观察菌体和菌体破碎液的颜色判定重组蛋白的可溶性表达量；通过测定特定可见光波长下重组蛋白的吸光度就可以获得重组蛋白的浓度。近年来，来源于细胞色素P450还原酶的黄素单核苷酸结合域(～21kDa)以及来源于细胞色素b5的血红素结合域(～13kDa)被用于融合蛋白标签，在可见光下这两个标签的颜色分别为黄色和红色(Biotechniques.2005,38(3):387-392；ProteinSci.2010,19(10):1830-1839)。然而由于这两种蛋白标签在大肠杆菌中的可溶性表达较低，并没有得到广泛应用。因此，开发能增加重组蛋白可溶性表达并且实现可视化的融合标签具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种包含血红素结合域的可视化融合标签在蛋白质表达纯化中的应用，可以解决通过肉眼观察重组蛋白在表达及纯化过程中变化的问题。本专利技术所要解决的问题是针对现有的肉眼可视化融合标签的种类很少，提供更多的可视化融合标签用于目标蛋白的表达，具体是提供一种包含来源于人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列，其序列如序列表中SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:1MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyMetProSerGluThrProGlnAlaGluValGlyProThrGlyCysProHisArgSerGlyProHisSerAlaLysGlySerLeuGluLysGlySerProGluAspLysGluAlaLysGluProLeuTrpIleArgProAspAlaProSerArgCysThrTrpGlnLeuGlyArgProAlaSerGluSerProHisHisHisThrAlaProAlaLysSerProLysIleLeuProAspIleLeuLysLysIleGlyAspThrProMetValArgIleAsnLysIleGlyLysLysPheGlyLeuLysCysGluLeuLeuAlaLysCysGluLeuValProArgGlySer；还包括一种将上述氨基酸序列作为可视化蛋白表达融合标签的用途；还包括用于上述用途的融合表达载体，该载体是将六个组氨酸、包含人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列和凝血酶酶切位点基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)而获得，即获得包含可视化蛋白标签的融合表达载体pET-hm14；还包括一种可视化融合蛋白表达系统，其至少包括上述的融合表达载体。上述的可视化蛋白表达融合标签包括来源于人胱硫醚β-合酶(CBS)氨基端的血红素(heme)结合域(第1-110位氨基酸残基)，它具有较强的水溶性，融合蛋白表达量更高，表现为肉眼可见的鲜红色。因此，在表达和纯化过程中可以实现目的蛋白的肉眼可视化跟踪，根据融合标签在420nm的特征吸收可以实现目的蛋白含量实时监测，根据重组蛋白溶液OD420/OD280比值可以实现目的蛋白纯度的实时监测，同时该可视化标签也大大提高了目的蛋白的可溶性表达。使用过程中，待表达的目的基因连接到pET-hm14载体实现可视化标签和目的基因的融合表达。为了方便目的蛋白的纯化，本专利技术在融合标签的氨基端加入六个组氨酸残基，利于使用Ni-NTA树脂亲和层析纯化融合蛋白；同时为了获得天然N端的目的蛋白，在融合标签的羧基端加入凝血酶酶切位点(LVPRGS)，在纯化融合蛋白后能够切除标签。本专利技术还公开了可视化蛋白表达融合标签的编码基因，其编码基因可以是序列表中SEQIDNo:2所示的DNA分子，当然，由于密码子的简并性，其它与SEQIDNo:2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的DNA分子也可用于构建本专利技术的融合标签蛋白。SEQIDNO:2ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCATGCCTTCTGAGACCCCCCAGGCAGAAGTGGGGCCCACAGGCTGCCCCCACCGCTCAGGGCCACACTCGGCGAAGGGGAGCCTGGAGAAGGGGTCCCCAGAGGATAAGGAAGCCAAGGAGCCCCTGTGGATTCGGCCCGATGCTCCGAGCAGGTGCACCTGGCAGCTGGGCCGGCCTGCCTCCGAGTCCCCACATCACCACACTGCCCCGGCAAAATCTCCAAAAATCTTGCCAGATATTCTGAAGAAAATCGGGGACACCCCTATGGTCAGAATCAACAAGATTGGGAAGAAGTTCGGCCTGAAGTGTGAGCTCTTGGCCAAGTGTGAGCTGGTGCCGCGCGGCAGC；优选应用实施例中选择的是：来源于灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的胆固醇酯酶基因，该基因在大肠杆菌中单独表达时的可溶性蛋白量很少(<10％)，而与本专利技术的可视化蛋白标签融合表达后，重组蛋白可溶性得到大幅度提高(>30％)。同时由于可视化标签的存在使胆固醇酯酶的表达和纯化过程可以实现肉眼可视化跟踪，目的蛋白浓度可以根据OD420的吸光度实时监测，目的蛋白纯度可以根据OD42本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含来源于人胱硫醚β‑合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列，其特征在于，其序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种包含来源于人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列，其特征在于，其序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。2.将权利要求1所述的包含来源于人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列作为可视化蛋白表达融合标签的用途。3.一种用...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛卫宁，尹新，王军，侯海，陈菲，吴平，闫莎莎，骞婧，徐春兰，尚晓娅，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61