诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。本发明专利技术诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基包括DEME基础培养基10‑15g/L，甘露醇0.1‑0.5mM，肝素钠4‑8U，L‑谷氨酰胺1‑1.5mM，丙酮酸钠0.5‑0.85mM，β‑巯基乙醇0.15‑0.2mM，粘连蛋白1‑3mg/L，定向分化诱导因子27‑39ng/mL和血清替代物。本发明专利技术诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，且本发明专利技术培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。

【技术实现步骤摘要】
诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法
本专利技术涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。
技术介绍
慢性肾脏疾病是临床常见的多发病之一。据最新流行病学调查显示，目前我国慢性肾脏疾病患者高达1.2亿，患病率高达10.8％，且呈现逐年不断增长的趋势。肾脏移植术是临床最有效的治疗手段，但该技术存在供体短缺、同种异体排斥反应和终身服用免疫抑制剂等问题。因此，寻找到具有强大的再生能力且无排斥反应的种子细胞就成为了解决该问题的关键。目前用于再生医学研究的细胞主要有成体干细胞和胚胎干细胞，但这两种细胞均存在某些弊端，比如成体干细胞的数量和增殖能力有限；而胚胎干细胞的使用面临道德伦理争议问题。近年来，诱导性多能干细胞的出现为再生医学的研究提供了比较理想的种子细胞。IPS细胞是用反转录病毒将多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc转染至体细胞，并使之重编程为能够无限增殖与分化的一类细胞，它与胚胎干细胞类似，体内外均能无限增殖，可分化为人体内几乎所有类型的细胞；同时，IPS具有取材简便、无免疫排斥反应、无道德伦理争议等优点，从而成为再生医学治疗研究中理想的种子细胞。但IPS细胞直接移植治疗存在致癌风险，必须在体外将其诱导为相对成熟的肾脏细胞才能用于移植治疗。目前在再生研究领域中主要采用细胞因子进行定向诱导分化，研究发现生肾因子活化素A、骨形成蛋白7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP7)、维甲酸(retinoicacid，RA)可以诱导鼠ES细胞向肾脏上皮细胞分化。利用ActivinA、BMP4、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicityfibroblastgrowthfactor，b-FGF)等细胞因子诱导人ES细胞分化并得到一群早期的CD326－CD56+细胞，而该群细胞可进一步分化为中胚层前体细胞。黄佳卉等人在《体外诱导人iPS细胞向肾脏细胞定向分化的实验研究》中将经Dispase消化后的iPS细胞采用机械切割法传代，mTeSR培养液培养约3d至80％融合，进行实验分组：对照组(正常mTeSR培养组)和诱导组(诱导培养液中含有以下因子：10ng/mL的生肾因子活化素A、BMP7、hVEGF和b-FGF，0.1mol/LRA，10μmol/Llithium)，隔日换液。诱导组培养21d后加入1/2体积的肾脏上皮细胞培养液继续培养7d，同时观察细胞形态变化(上海交通大学学报(医学版)，2014，34(7):957-961.)。目前，体外诱导人IPS细胞向肾脏细胞定向分化培养基，诱导率低，且培养基多含有胎牛血清，不能满足研究生产的大量需要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基。本专利技术定向分化培养基，能有效促进IPS细胞向肾脏细胞定向分化，本专利技术诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，用本专利技术制备的定向分化培养培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cadmRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cadmRNA可上调10、50、55和40倍，此外，本专利技术培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。本专利技术通过以下技术方案实现：一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，包括DEME基础培养基10-15g/L，甘露醇0.1-0.5mM，肝素钠4-8U，L-谷氨酰胺1-1.5mM，丙酮酸钠0.5-0.85mM，β-巯基乙醇0.15-0.2mM，粘连蛋白1-3mg/L，定向分化诱导因子27-39ng/mL和血清替代物。优选地，所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A11-12.5ng/mL、人血管内皮生长因子7.5-9ng/mL、β-磷酸甘油3.5-7.5ng/mL及丹参酮ⅡA5-10ng/mL。优选地，所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白5-10g/L，转铁蛋白0.3-0.5g/L，重组人表皮生长因子0.5-1.5ng/mL，成纤维细胞生长因子1-2ng/mL，血小板来源的生长因子0.75-2.5ng/mL，甘氨酸3.5-6.5g/L，脯氨酸0.1-0.3g/L，酪氨酸磷酸肽2-4g/L和维生素D0.3-1.2mg/L。优选地，所述燕麦蛋白的提取方法为：称取脱脂燕麦，按浸提料液质量比1:9的比例加入pH值为10.2的氢氧化钠溶液进行浸提：浸提温度为46℃，浸提时间为3h，10000r/min离心20min，取上清液并用1mol/L盐酸调节pH至4，10000r/min离心20min，将沉淀物水洗两次后喷雾干燥即得。一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法，包括以下步骤：S1收集活化后的诱导多能干细胞，4℃，200g/min离心3-5min后弃上清后，加入细胞培养液1-3mL悬浮细胞，吸取细胞悬液到15mL离心管中，200g/min离心3-5min，弃上清加入2mL细胞培养液悬浮细胞，并将细胞悬液加入细胞培养皿中于细胞培养箱中培养2小时；S2吸取S1中培养2小时后的细胞悬液，按体积比1:20-1:25接种量接种于含成纤维细胞生长因子的DMEM培养液中，培养3-4天后，更换所述定向分化培养基，并定期观察，即得。优选地，所述步骤S1中细胞培养液为DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和7.5mg/L甘氨酰丙氨酸。本专利技术诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基所用定向分化诱导因子中含有能够促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化的生肾因子活化素A和人血管内皮生长因子；此外本专利技术技术人员发现将β-磷酸甘油、丹参酮Ⅱ添加到本专利技术培养基体系中能够提高生肾因子活化素A和人血管内皮生长因子的诱导能力。细胞生长环境中的渗透压对细胞增殖和分化有重要的影响作用，本专利技术诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基中甘露醇和其它成分相互作用不仅能维持诱导多能干细胞分化所需的渗透压，并且加快了诱导多能干细胞向肾脏干细胞定向分化的速度。本专利技术培养基中利用血清替代物替代了胎牛血清，其中燕麦蛋白中含有丰富的氨基酸群且必需氨基酸比重较高，与甘氨酸，脯氨酸和酪氨酸磷酸肽共同使用为细胞生长提供了充足的氨基酸；并且酪氨酸磷酸肽和维生素D相互发挥协同作用，促进矿物质的运输和吸收；重组人表皮生长因子，成纤维细胞生长因子和血小板来源的生长因子有助于细胞的生长。此外，本专利技术在进行诱导多能干细胞定向分化培养时，用本专利技术提供的细胞培养液培养诱导多能干细胞有助于其向肾脏细胞定向分化。与现有技术相比，本专利技术培养基中各成分间具有协同作用，能显著促进诱导干细胞向肾脏细胞的定向分化。本专利技术的诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，用本专利技术制备的定向分化培养培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cadmRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cadmRNA可上调10、5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，包括DEME基础培养基10‑15g/L，甘露醇0.1‑0.5mM，肝素钠4‑8U，L‑谷氨酰胺1‑1.5mM，丙酮酸钠0.5‑0.85mM，β‑巯基乙醇0.15‑0.2mM，粘连蛋白1‑3mg/L，定向分化诱导因子27‑39ng/mL和血清替代物。

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，包括DEME基础培养基10-15g/L，甘露醇0.1-0.5mM，肝素钠4-8U，L-谷氨酰胺1-1.5mM，丙酮酸钠0.5-0.85mM，β-巯基乙醇0.15-0.2mM，粘连蛋白1-3mg/L，定向分化诱导因子27-39ng/mL和血清替代物。2.根据权利要求1所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A11-12.5ng/mL，人血管内皮生长因子7.5-9ng/mL，β-磷酸甘油3.5-7.5ng/mL及丹参酮ⅡA5-10ng/mL。3.根据权利要求1所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白5-10g/L，转铁蛋白0.3-0.5g/L，重组人表皮生长因子0.5-1.5ng/mL，成纤维细胞生长因子1-2ng/mL，血小板来源的生长因子0.75-2.5ng/mL，甘氨酸3.5-6.5g/L，脯氨酸0.1-0.3g/L，酪氨酸磷酸肽2-4g/L和维生素D0.3-1.2mg/L。4.根据权利要求3所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述燕麦蛋白的提取方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：车七石，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44