可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用技术

本发明专利技术公开了可传代培养的羊睾丸细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用，提供了一株可传代培养的羊睾丸传代细胞LT‑1(CGMCC No.12988)以及驯化培养获得该细胞的方法。本发明专利技术采用优化的细胞培养液对羊睾丸原代细胞(LT)进行传代驯化培养，可使羊睾丸原代细胞增加传代次数，适于批量生产；并利用该细胞对羊口疮病毒进行增殖培养，结果显示，羊口疮病毒能连续传代培养3代，均能产生明显的病变，病毒含量可达10

【技术实现步骤摘要】
可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用
本专利技术属于细胞与组织培养领域中细胞的培养方法和培养体系，特别是涉及一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)得到可传代培养的羊睾丸传代细胞(LT-1)的方法及其专用培养体系与应用。
技术介绍
目前，羊睾丸细胞(LT)均是来源于羔羊睾丸，经解剖、剪碎、消化、培养而成的原代细胞，该细胞生长缓慢，繁殖一定代数后(一般10代以内)停止生长，传代次数有限，随着传代次数的升高，细胞活力降低，细胞形态也随之越来越差，最后无法进行传代；并且羔羊睾丸来源有限，采集工作量大，易污染，费时费事；细胞制作过程复杂耗时，不利于批量生产使用。
技术实现思路
为克服羊睾丸原代细胞(LT)培养的不足，实现羊睾丸细胞的批量培养，本专利技术的专利技术人长期致力于羊睾丸原代细胞的传代驯化研究，通过个性化的培养基，优化驯化途径，最终获得了一株可以传代培养的羊睾丸细胞。本专利技术的第一个目的是提供一株可传代培养的羊睾丸传代细胞，命名为LT-1，该株细胞已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.12988。本专利技术的第二个目的是提供一种用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的培养体系。本专利技术所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系包括细胞培养液Ⅰ、细胞培养液Ⅱ和细胞培养液Ⅲ；所述细胞培养液Ⅰ为含有10％(体积百分比V/V)新生牛血清和1％-3％(质量体积百分比W/V)L-谷氨酰胺的MEM培养液，所述细胞培养液Ⅱ是含有10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液所述细胞培养液Ⅲ为含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液。本专利技术所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系还包括消化液Ⅰ和消化液Ⅱ，所述消化液Ⅰ为0.25％(W/V)的胰酶消化液，所述消化液Ⅱ为含有0.25％(W/V)胰酶和0.02％(W/V)EDTA的EDTA-胰酶消化液。本专利技术的第三个目的是提供一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的方法。本专利技术所提供的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，是将羊睾丸原代细胞用细胞培养液Ⅰ进行传代培养至7-8代，再逐次用细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养至20代、30代，最后用细胞培养液Ⅲ逐步适应传代至40-50代得到可传代的羊睾丸细胞LT。这里，每次传代培养后用消化液Ⅱ封口，再消化细胞后加入细胞培养液。具体的，可包括以下步骤：1)取用公羊睾丸；2)获得羊睾丸原代细胞：将羊睾丸经清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，加入消化液Ⅰ，封口，将其放入水浴锅中消化约20-30分钟，取出，加入细胞培养液Ⅰ终止消化，轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睾丸细胞均匀分散开，用无菌纱布过滤，取透过液体，置于细胞瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，由此得到羊睾丸原代细胞；3)羊睾丸原代细胞的传代：将羊睾丸原代细胞在恒温环境中进行培养，待羊睾丸细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化，取出，加入细胞培养液Ⅰ进行传代培养；4)按照步骤3)中的方法将羊睾丸原代细胞传至7-8代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；5)按照步骤4)中的方法将羊睾丸原代细胞传至20代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；6)按照步骤5)中的方法将羊睾丸原代细胞传至30代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅲ继续进行传代培养；7)按照步骤6)中的方法将羊睾丸原代细胞传至40-50代，得到可以传代的羊睾丸细胞。在上述传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法中，所述步骤1)的公羊为2-4月龄的小公羊。所述步骤2)中玻璃珠的直径为2-3mm，优选为2.5mm，粒数为100-150，优选120；消化液Ⅰ的添加量为30-50mL，优选40mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为20-30分钟，优选30分钟；细胞培养液Ⅰ的添加量为300-500mL，优选300mL；无菌纱布的层数为6-8层，优选为8层。所述3)羊睾丸原代细胞的传代：所述羊睾丸原代细胞的培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选2分钟；细胞培养液Ⅰ的添加量为20-25mL(细胞瓶培养面积为25cm2)，优选20mL,平分为两瓶进行培养(分种比例为1:2),培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时,以细胞长满单层的时长为准。所述步骤4)将羊睾丸原代细胞传至7-8代时，细胞开始生长更加缓慢，且形态不佳，此时需减小分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)的分种比例进行消化传代培养，优化细胞培养液为细胞培养液Ⅱ；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅱ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。所述步骤5)将羊睾丸原代细胞传至20代时，细胞生长较快，且形态较好，可适当扩大分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(2-3)的分种比例进行消化传代培养；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅱ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。所述步骤6)中将羊睾丸原代细胞传至30代时，优化细胞培养液为培养液Ⅲ，同时降低分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)继续进行传代培养；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅲ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。所述步骤7)中将羊睾丸原代细胞传至50代时，挑选得到一株可以传代培养的羊睾丸传代细胞，命名为LT-1。该株细胞已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.12988。本专利技术的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCCNo.12988)可用于羊口疮病毒的增殖培养，包括以下步骤：用细胞培养液Ⅲ(含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液)培养羊睾丸传代细本文档来自技高网...

【技术保护点】
羊睾丸传代细胞LT‑1，保藏编号为CGMCC No.12988。

【技术特征摘要】
1.羊睾丸传代细胞LT-1，保藏编号为CGMCCNo.12988。2.一种用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的培养体系，包括细胞培养液Ⅰ、细胞培养液Ⅱ和细胞培养液Ⅲ，所述细胞培养液Ⅰ为含有10％(V/V)新生牛血清和1％-3％(W/V)L-谷氨酰胺的MEM培养液，所述细胞培养液Ⅱ是含有10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液所述细胞培养液；所述细胞培养液Ⅲ为含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液。3.根据权利要求2所述用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系，还包括消化液Ⅰ和消化液Ⅱ，所述消化液Ⅰ为0.25％(W/V)的胰酶消化液，所述消化液Ⅱ为含有0.25％(W/V)胰酶和0.02％(W/V)EDTA的EDTA-胰酶消化液。4.一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的方法，用权利要求2或3所述的培养体系，包括以下步骤：将羊睾丸原代细胞用细胞培养液Ⅰ进行传代培养至7-8代，再逐次用细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养至20代、30代，最后用细胞培养液Ⅲ逐步适应传代至40-50代得到可传代的羊睾丸细胞LT。5.根据权利要求4所述的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，其特征在于：每次传代培养后用消化液Ⅱ封口，再消化细胞后加入细胞培养液。6.根据权利要求4或5所述的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，其特征在于：具体采取以下步骤：1)取用公羊睾丸；2)获得羊睾丸原代细胞：将羊睾丸经清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，加入消化液Ⅰ，封口，将其放入水浴锅中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅰ终止消化，轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睾丸细胞均匀分散开，用无菌纱布过滤，取透过液体，置于细胞瓶中，得到羊睾丸原代细胞；3)羊睾丸原代细胞的传代：将羊睾丸原代细胞在恒温环境中进行培养，待羊睾丸细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，封口，将其放入水浴锅中消化，取出，加入细胞培养液Ⅰ进行传代培养；4)将羊睾丸原代细胞按步骤3)传至7-8代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入水浴锅中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；5)将羊睾丸原代细胞按步骤4)传至20代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入水浴锅中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；6)将羊睾丸原代细胞按步骤5)传至30代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入水浴锅中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅲ继续进行传代培养；7)将羊睾丸原代细胞按步骤6)传至40-50代，得到可以传代的羊睾丸细胞。7.根据权利要求6所述的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)的公羊为2-4月龄的小公羊；所述步骤2)中玻璃珠的直径为2-3mm，优选为2.5mm，粒数为100...

【专利技术属性】
技术研发人员：路荣，刘国英，范秀丽，张燕红，高艳华，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15