光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法，所用背景菌株为亚洲型禾谷镰刀菌，对亚洲型禾谷镰刀菌中的一个小的LOV结构域蛋白编码基因Favvd进行敲除，获得能持续进行光响应的突变菌株。主要包括如下步骤：利用同源重组片段构建法，将目的基因Favvd的5'‑UTR和3'‑UTR分别与潮霉素基因Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得在光诱导条件下高产类胡萝卜素的突变菌株ΔFavvd。该菌株产类胡萝卜素的效率显著提升，能持续响应光信号，具有培养简单，生长速度快，产率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建
本专利技术涉及一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建，属于生物

技术介绍
类胡萝卜素是一类呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，因其分布广泛、结构多样及功能较多而成为一种重要的天然色素。它同时存在于植物、动物和微生物中。类胡萝卜素因其结构特性而具有多种生物功效，研究表明，类胡萝卜素可能具有防治心脏病、癌症、白内障和几种人体慢性疾病的作用和其他生物活性作用。此外，类胡萝卜素作为一种优良的食品添加剂和改善人类营养的营养增补剂，它的优良品质和效果，很久以来就被世界各国所公认，被誉为最有希望的抗氧化剂。类胡萝卜素由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来备受人们青睐。从天然食物提取类胡萝卜素工艺复杂并且成本较高，因此通过微生物发酵法生产类胡萝卜素已成为研究热点。在丝状真菌中，类胡萝卜素的合成非常普遍，类胡萝卜素使得真菌呈现从黄色到深红色等不同的颜色。许多镰刀菌表面呈现的红色色素是由于光诱导形成的链孢霉黄素(neurosporaxanthin)——一种酸性的脱辅基类胡萝卜素。链孢霉黄素最先在粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)中发现。研究表明，粗糙脉孢菌的类胡萝卜素合成与其光响应过程有关。在粗糙脉孢菌中，蓝光受体是主要的光响应承担者，它含有三个组分：WC1、WC2和VVD，其中WC1是一个GATA锌指结构域的转录因子，它既有能够感应光的LOV结构域，又含有具有转录调节功能的锌指结构域，WC2也是一个GATA锌指结构域蛋白，它能够和WC1结合成为WCC复合体，在光照条件下结合在光响应基因的启动子上，启动基因的表达，VVD是一个小的LOV结构域蛋白，是由WCC复合体的下游光响应基因编码的，在光照时间延长或光照强度增加的情况下，VVD能够抑制WCC复合体的作用，解除WCC对光响应基因的调控，从而使光响应基因的表达恢复到原始水平，形成光适应现象。光响应基因中包含很多类型的基因，如参与孢子形成的基因、参与光修复的基因，以及大量参与次级代谢的基因，其中就包括类胡萝卜素生物合成相关的基因。本专利技术采用同源重组法构建片段，PEG介导的原生质体转化法进行转化，将亚洲专化型禾谷镰刀菌的蓝光受体基因Favvd进行敲除，获得的突变体在光照条件下失去光适应能力，持续光照能导致该菌株维持较高的光响应水平，因此获得了一株在光照条件下高产类胡萝卜素的基因工程菌株，相对于普通野生型菌株，突变菌株的类胡萝卜素产量提高了约4倍。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法。本专利技术的方法将丝状真菌禾谷镰刀菌中的蓝光受体基因进行敲除，从而获得发酵时高产类胡萝卜素的突变菌株。所述突变菌株产类胡萝卜素的效率显著提升，不仅发酵时类胡萝卜素产量高，并且培养简单，生长速度快，既可用于类胡萝卜素的工业发酵生产，又可为研究丝状真菌的光响应机制提供现实依据。本专利技术采用将亚洲型禾谷镰刀菌(Fusariumasiaticum)的蓝光受体基因Favvd进行敲除的方法，获得了一株光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌突变菌株。本专利技术所采用的背景菌株EXAP-08是从芦笋上分离的一株禾谷镰刀菌，经ITS序列鉴定确定其为禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)第六世系的亚洲专化型禾谷镰刀菌，该菌株是亚洲地区专有的一类禾谷镰刀菌。通过使用禾谷镰刀菌标准菌株PH-1蓝光受体基因Fgvvd的外围引物，对EXAP-08中的相关基因进行PCR扩增，将扩增产物进行测序和序列比对，发现该基因与Fgvvd序列相似性达到99％以上，再进行氨基酸序列比对和结构域分析，发现该基因编码的蛋白质与已经报道的其他几种真菌中的VVD蛋白高度相似，因此将其确定为亚洲专化型禾谷镰刀菌的蓝光受体基因，并命名为Favvd。该基因序列已经上传于NCBI数据库，编号为Genbank：KX907849。所述背景菌株亚洲型禾谷镰刀菌(Fusariumasiaticum)已在非专利文献ZhuP.,WuL.,LiuL.etal.2013.Fusariumasiaticum:anemergingpathogenjeopardizingpostharvestasparagusspears.JournalofPhytopathology161(10):696-703.中进行了记载。本专利技术所采用的背景菌株可以是任意已知的禾谷镰刀菌属的菌株，并不限于所述的亚洲专化型禾谷镰刀菌(Fusariumasiaticum)。本专利技术首次利用真菌的光生物学原理来制备高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株，具体为：禾谷镰刀菌的蓝光受体WC-1和WC-2组成的WCC复合体在光照下能激活大多数光响应基因的表达，其中包括一个小的LOV结构域的蓝光受体编码基因Favvd的表达，当光照时间延长或光照强度增加时，FaVVD能抑制WCC复合体的这种刺激作用，从而使光响应基因的表达量恢复到原始水平，形成光适应现象；如果FaVVD缺失后，对WCC复合体的抑制作用消失，以上所述的光适应现象也将消失。本专利技术首次发现在禾谷镰刀菌中，蓝光受体能够通过光适应现象来调节类胡萝卜素的合成，因此，将基因Favvd敲除后，类胡萝卜素合成的光适应现象就会消失，相关基因会在持续光照下维持高表达水平，从而使类胡萝卜素的合成持续高效进行，这时就会在菌丝内积累大量的类胡萝卜素。这一原理的应用不仅使得镰刀菌能大量产生可用于工业生产的类胡萝卜素，而且可以用于研究真菌的光生物学的其他机理，是本研究领域的一项创新专利技术。本专利技术是通过以下技术方法实现的，本专利技术涉及的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建包括如下步骤：对禾谷镰刀菌中的一个小的LOV结构域蛋白编码基因进行敲除，获得能持续进行光响应的突变菌株。利用同源重组片段构建法，将目的基因Favvd的5'-UTR和3'-UTR分别与潮霉素基因Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得在光诱导条件下高产类胡萝卜素的突变菌株ΔFavvd。该突变菌株的光响应基因包含类胡萝卜素合成相关基因，将蓝光受体基因Favvd敲除后，突变菌株能持续进行光响应，因此在持续光照条件下能大量产生类胡萝卜素。所述LOV结构域蛋白编码基因是蓝光受体基因Favvd，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述蓝光受体基因编码的蛋白质FaVVD是禾谷镰刀菌光适应功能的承担者，缺失后禾谷镰刀菌无法进行光适应。禾谷镰刀菌的光适应现象包括光照时间延长和光照强度增加时类胡萝卜素合成基因表达量的下调。光适应能力缺失后，在持续光照下，突变菌株类胡萝卜素合成基因持续高表达，从而产生大量类胡萝卜素。采用同源重组技术敲除禾谷镰刀菌的蓝光受体基因Favvd，即用潮霉素抗性基因替代目的基因表达框区域来达到使目的基因突变的目的。本专利技术光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：(a)在潮霉素抗性基因Hph包含启动子的编码区的5'端连接蓝光受体基因Favvd的起始密码子上游大约1kb的非编码区，构建上游融和片段；(b)在潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区的3'本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将产类胡萝卜素的菌株的蓝光受体基因进行敲除，得到所述光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株。

【技术特征摘要】
1.一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将产类胡萝卜素的菌株的蓝光受体基因进行敲除，得到所述光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述产类胡萝卜素的镰刀菌菌株，含亚洲型禾谷镰刀菌(Fusariumasiaticum)。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蓝光受体基因为一个小的LOV结构域蛋白编码基因Favvd，序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(a)在潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区的5'端连接蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区，构建上游融合片段5'Favvd-U-Hph；(b)在潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区的3'端连接蓝光受体基因Favvd终止密码子下游非编码区，构建下游融合片段3'Favvd-D-Hph；(c)采用PEG介导的原生质体转化法，将步骤(a)和步骤(b)获得的上游融合片段、下游融合片段进行扩增后，同时转入产类胡萝卜素的菌株的原生质体中；其中，所述Favvd起始密码子上游非编码区为964bp，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区为1323bp，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述Favvd终止密码子下游非编码区为971bp，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区为1313bp，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，用于扩增所述蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区的特异性引物为Favvd-U-F、Favvd-U-R：Favvd-U-F：GGAGAAGTAGACCGATGGG；Favvd-U-R：CCACAGCTGCAGTCTAGAGCGGTCGAACAATGAGGAGAGGG；用于扩增包含Olic启动子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的引物为U-Hph-F、U-Hph-R：U-Hph-F：CCCTCTCCTCATTGTTCGACCGCTCTAGACTGCAGCTGTGG；U-Hph-R：CCCTCTCCTCATTGTTCGACCGCTCTAGACTGCAGCTGTGG；用于扩增所述蓝光受体基因Favvd终止密码子下游非编码区的引物为Favvd-D-F、Favvd-D-R：Favvd-D-F：GTTGTCTAAGCGGATCCCGATCACAGCCATTCAAAACGA；Favvd-D-R：ACAGCTAACGGGTTGAGAGA用于扩增包含终止子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的引物为D-Hph-F和D-Hph-R：D-Hph-F：TCGTTTTGAATGGCTGTGATCGGGATCCGCTTAGACAACD-Hph-R：TCGTTTTGAATGGCTGTGATCGGGATCCGCTTAGACAAC。6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，扩增所述蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区的PCR体系为：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA2μl；上游引物Favvd-U-F2μl；下游引物Favvd-U-R2μl；2×高保真magicMix25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第一片段；用于扩增包含Olic启动子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的PCR体系为：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA2μl；上游引物U-Hph-F2μl；下游引物U-Hph-R2μl；2×高保真magicMix25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第二片段；利用引物Favvd-U-F和U-Hph-R制备上游融合片段5'Favvd-U-Hph的PCR体系为：第一片段900ng；第二片段900ng；上游引物Favvd-U-F2μl；下游引物U-Hph-R2μl；2×高保真magicMix25μl，双蒸水补充体积至50μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，得到上游融合片段5'Favvd-U-Hph...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱品宽，曲耀，卢正宇，黄丽，王奕文，倪兵，许玲，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31