SPNP‑27在制备TTX‑S钠通道抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生物活性多肽在制备电压门控钠通道工具试剂‑TTX‑S型钠通道抑制剂中的应用方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钠肽‑27（SPNP‑27），试验验证该活性多肽对TTX‑S型电压门控钠通道具有明显的抑制作用。在制备电压门控钾通道亚型工具试剂时，配制细胞外给药的浓度为1µmol/L或10µmol/L。SPNP‑27对TTX‑S型钠通道的抑制呈现浓度依从性和时间依从性，是一种较好的TTX‑S型钠通道工具试剂。

【技术实现步骤摘要】
SPNP-27在制备TTX-S钠通道抑制剂中的应用
本专利技术涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27（简写为SPNP-27）在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂中的用途。
技术介绍
电压门控钠通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钠通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钠通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。它们通过与钠通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27（简写为SPNP-27），其氨基酸序列为：NH2-AspCysLeuGlyLeuPheTrpIleCysGlnTyrMetAspAspLysCysCysProGlyTyrLysCysGluArgSerSerProTrpCysLysIleAspIleTrp-NH2,其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27作为单一有效活性组份用于制备TTX-S型钠通道抑制剂。所述的蜘蛛抑钠肽-27的N端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之间，N端第16位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。该蜘蛛抑钠肽-27作为单一有效活性组分用于制备TTX-S型钠通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成TTX-S型钠通道工具试剂。蜘蛛抑钠肽-27在制备TTX-S型钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为1µmol/L或10µmol/L。蜘蛛抑钠肽-27对TTX-S型钠通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的TTX-S型钠通道工具试剂。附图说明图1是1µmol/LSPNP-27对大鼠DRG神经元上TTX-S型钠通道的影响。图2是10µmol/LSPNP-27对大鼠DRG神经元上TTX-S型钠通道的影响。具体实施方式为了更好的理解和更充分公开本专利技术，下面将通过细胞外给药途径，采用大鼠背根神经节细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-27的TTX-S型钠通道抑制作用。1、实验材料和方法1.1大鼠背根神经节细胞（DRG细胞）的急性分离培养挑选出生4周左右、体重140～200g的SD大白鼠，断颈处死后，用剪子迅速取出脊椎并剪成2～3段，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量培养液的烧杯中;用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维。在胸腰椎段，可挑选18个左右并置入盛有2mL培养液的培养皿中;在解剖显微镜下，用尖头镊子和维娜斯剪分离出神经节。剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5mL培养液的培养皿中。用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎，越碎越好。剪碎之后，转入消化液,在34℃、震荡频率110rpm的环境中进行酶解消化反应20min。期间每隔10min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入胰酶抑制剂，终止酶解。无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心（800rpm、5min），去上清，加入8mL含10%小牛血清的长期培养液。重悬细胞后分成3～4皿，放入培养箱（5%CO2、95%空气）中，37℃培养3～4h贴壁。1.2膜片钳电生理活性实验膜片钳实验均在室温（25±1℃）进行，采用全细胞膜片钳技术。挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞或者有绿色荧光的HEK293T细胞作为实验细胞。电流记录通过全细胞膜片钳技术利用EPC9放大器(HEKA公司,German)在电脑上进行。计算机记录和分析系统采用Pulse+Pulsefit8.0软件。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管（南京泉水教学实验器材厂）。玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪(Narishige,Japan)抛光后电极尖端直径约为3μm，充灌电极液后电极电阻为1-3MΩ。膜片钳实验要在室温条件下进行，整个实验过程中温度的变动最多上下不超过2℃。采用SigmaPlot9.0软件分析实验结果。2、实验结果与分析2.1SPNP-27对TTX-S型电压门控钠通道的影响我们检测了SPNP-27对DRG细胞TTX-S型电压门控钠通道的影响。结果如图1、图2所示，我们采用细胞外给药的方式发现，1µM和10µM的SPNP-27对TTX-S钠通道都有明显的抑制作用，最大抑制率分别为61%和92%。SPNP-27对TTX-S钠通道的抑制作用呈现浓度依赖性。SPNP-27抑制TTX-S型钠电流速度都非常迅速，具有时间依从性。当浓度为10μM时，可在约2min的时间内达到92%的抑制程度。SEQUENCELISTING<110>长沙沁才生物科技有限公司<120>蜘蛛抑钠肽-27<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>34<212>PRT<213>广西缨毛蛛<400>1AspCysLeuGlyLeuPheTrpIleCysGlnTyrMetAspAspLys151015CysCysProGlyTyrLysCysGluArgSerSerProTrpCysLys16202530IleAspIleTrp31本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钠肽‑27在制备电压门控钠通道工具试剂‑TTX‑S型钠通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钠肽‑27（简写为SPNP‑27），其氨基酸序列为：NH2‑ Asp Cys Leu Gly Leu Phe Trp Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Lys Cys CysPro Gly Tyr Lys Cys Glu Arg Ser Ser Pro Trp Cys Lys Ile Asp Ile Trp‑NH2,其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钠肽‑27作为单一有效活性组份用于制备TTX‑S型钠通道抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27（简写为SPNP-27），其氨基酸序列为：NH2-AspCysLeuGlyLeuPheTrpIleCysGlnTyrMetAspAspLysCysCysProGlyTyrLysCysGluArgSerSerProTrpCysLysIleAspIleTrp-NH2,其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-27作为单一有效活性组份用于制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：长沙沁才生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43