一种牛支原体灭活疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种牛支原体灭活疫苗的制备方法。本发明专利技术从牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件，牛支原体灭活疫苗免疫剂量，牛支原体灭活疫苗的免疫方式，牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体甲醛灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫剂量，牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂，然后在临床上进行动物本体试验，结果表明本发明专利技术的牛支原体灭活疫苗在临床应用中对牛只牛支原体疾病的预防具有良好的效果，可作为一种临床推广疫苗进行使用，为牛支原体疾病的预防奠定了科学的基础。

Preparation and application of inactivated vaccine of Mycoplasma bovis

The invention discloses a method for preparing a bovine mycoplasma inactivated vaccine. The invention of inactivated vaccine of Mycoplasma bovis prepared from formalin inactivated conditions, Mycoplasma bovis vaccine, inactivated Mycoplasma bovis vaccine, inactivated vaccine of Mycoplasma bovis adjuvant use and clinical application study, find out the best immune dose of Mycoplasma bovis formalin inactivated conditions, cattle Mycoplasma bovis inactivated vaccine, inactivated vaccine and immune adjuvant, animal body test in clinic and the results show that there are good effect to prevent the Mycoplasma bovis vaccine in clinical application of bovine cattle Mycoplasma disease, can be used as a vaccine for clinical use. Lay a scientific basis for prevention of Mycoplasma bovis disease.

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体灭活疫苗的制备方法及应用
本专利技术涉及一种牛支原体灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis)是引起牛呼吸道炎症、乳腺炎和关节炎等多系统炎症的重要致病性病原体之一。1961年Hale等在美国首次从患乳腺炎牛的乳汁中分离得到该病原；此后在爱尔兰、南美洲及欧洲等地区均分离到牛支原体。2008年，我国湖北省暴发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，以后相继在湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等地区引进犊牛中发现该病，发病率为50%~100%，病死率高达10%~50%，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体的免疫机制非常复杂且特殊，至今尚未完全清楚。研究表明牛支原体与宿主免疫细胞相互作用能产生两种现象：免疫增强和免疫抑制。由于牛支原体基因的DNA高频率重组，表面脂蛋白具有高度的特异性，这就使牛支原体表型多变，也使得国内外有关疫苗的研究进程缓慢，只有美国将商品化的牛支原体疫苗投放市场，目前只有唯一的呼吸道合胞病毒、副流感2型和3型、特异支原体和牛支原体四联灭活苗用于牛支原体感染，能提供短暂的保护作用且副作用大。近年来有人用福尔马林灭活牛支原体后研制出了牛支原体全细胞灭活苗，但它对由牛支原体引发的乳房炎没有效果。据1981年和1987年的牛支原体疫苗保护性试验发现，当时存在的疫苗对牛的支原体性肺炎具有一定效果，但有的疫苗反而会加剧牛支原体的感染。1987年Barite等用仓鼠对牛支原体菌苗和福尔马林灭活苗做了检测，两种疫苗可以预防牛支原体肺炎，但是两者的交互作用无法辨别。美国虽有两种商品化疫苗，但2011年有人对这两种疫苗的保护性做了测试，通过27d小牛免疫试验表明，两种疫苗中一种可以明显提高抗体水平，但是对牛的保护率约44%;另外一种疫苗的免疫效果不显著。
技术实现思路
本专利技术公开了一种牛支原体灭活疫苗的制备方法。本专利技术从牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件，牛支原体灭活疫苗免疫剂量，牛支原体灭活疫苗的免疫方式，牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体甲醛灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫剂量、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂。本专利技术主要是制备一种牛支原体疫苗。其主要包括牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件的筛选，牛支原体灭活疫苗免疫剂量筛选，牛支原体灭活疫苗的免疫方式筛选，牛支原体灭活疫苗使用的佐剂筛选。牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件研究将冻存的M.bovis菌株复苏后，接种到M.bovis液体培养基，在一定条件下进行培养，3d后传代，测出第四代M.bovis培养物中CCU含量，按一定比例浓缩后得到1.0×1010ccu/ml的M.bovis培养物备用，在培养物中加入甲醛（分析纯）使其终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%，充分混合后在同样的条件下培养，每隔12h测定M.bovisCCU含量，每个浓度测定3次，取平均值。当CCU含量为0时将培养物以16000r/min离心30min，将得到的沉淀用0.1mol/L的PBS洗涤3次，然后以1:10在液体培养基中盲传3代同时接种固体培养基观察灭活效果。牛支原体灭活疫苗免疫剂量研究将12只试验动物分为A、B、C、D4组，每组3只（雌雄搭配，体重搭配），以免疫前一天记为0d，在实验第1d用试验三中保存的未加佐剂1.0×1010CCU/ml的疫苗通过肌注的方式对A、B、C组试验动物进行免疫，A组1ml/只，B组2ml/只，C组3ml/只；第15d时以同样的方式和剂量进行加强免疫，D组不做任何处理为阴性对照。从0d起每隔10d颈静脉采血，连续7次，每次采血1ml以3000r/min的转速离心20min分离血清，将血清置于-80℃的冰箱保存备用。牛支原体灭活疫苗的免疫方式研究将试验动物隔离饲养一周适应实验环境，将9只试验动物分为A、B、C3组，每组3只（雌雄搭配，体重搭配），以免疫前一天为0d，在实验第1d用试验三中保存的未加佐剂1.0×1010CCU/ml的疫苗对试验动物进行免疫，A组以滴鼻的方法注射1ml/只，B组以肌注的方法注射1ml/只，C组以皮下注射的方法进行1ml/只；第15d时以同样的方式和剂量加强免疫，从0d起每隔10d颈静脉采血，连续7次，每次采血1-2ml以3000r/min的转速离心20min分离血清，将血清于-80℃的冰箱保存备用。牛支原体灭活疫苗使用的佐剂研究将试验动物隔离饲养一周观察临床症状，待试验动物适应新环境后开始实验，将12只试验动物分为A、B、C、D4组，每组3只（雌雄搭配，体重搭配），以免疫前一天为0d，在实验第1d用试验三中保存的疫苗对试验动物进行免疫，A组肌注5×109CCU/ml的氢氧化铝佐剂灭活苗1ml/只，B组肌注5×109CCU/ml的弗式完全佐剂灭活苗1ml/只，C组肌注5×109CCU/ml的白油佐剂灭活苗1ml/只，D组肌注×109CCU/ml的未加佐剂灭活苗1ml/只，第15d时以同样的方式和剂量注射同种疫苗来加强免疫，从0d起每隔10d颈静脉采血一次，连续采血7次，每次采血1ml以3000r/min的转速离心20min分离血清，将血清于-80℃的冰箱保存备用。牛支原体疫苗的制备及临床应用将牛支原体以1:100的比例接种到牛支原体Thiaucourt’s液体培养基中，5%C02，37℃条件下培养3d得到F1代菌液，再将F1菌液以1:100接种到液体培养基中，5%C02，37℃条件下培养3d得到F2，将F2培养物以1:10接种到液体培养基中，5%C02，37℃条件下培养3d得到F3代菌液；然后测定F3代菌液浓度（CCU/ml）并在F3代菌液中加入甲醛溶液，使菌液中甲醛终浓度为0.4%，37℃条件下灭活，2d后抽取灭活菌液接种于Thiaucourt’s固体培养基进行检活。将灭活后并未检测到活菌的F3代灭活菌液16000r/min离心30min，将得到的沉淀物经用理盐水缓冲液洗涤3次，然后用生理盐水将沉淀物稀释至原来浓度。洗涤后的灭活菌液与白油佐剂进行等体积混合，100W，间隔2s，10min超声乳化。然后接种于牛只进行临床观察、病理组织学观察和抗体水平检测。附图说明图1为支原体含量随不同灭活时间的变化曲线。图2为体温变化趋势。图3为PC组病理剖检病变组织。图4为PC组肺脏：细支气管缩小，皱襞增多，官腔内有少量脱落的上皮细胞100×。图5为PC组肺脏：细支气管缩小，皱襞增多400×。图6为PC组肺脏：肺泡塌陷、肺泡隔增厚，组织增生100×。图7为PC组肺脏：肺泡塌陷，肺泡隔增厚，肺泡腔内有少量细胞脱落400×。实施例1：1、牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件研究将冻存的M.bovis菌株复苏后，接种到M.bovis液体培养基，在一定条件下进行培养，3d后传代，测出第四代M.bovis培养物中CCU含量，按一定比例浓缩后得到1.0×1010ccu/ml的M.bovis培养物备用，在培养物中加入甲醛（分析纯）使其终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%，充分混合后在同样的条件下培养，每隔12h测定M.bovisCCU含量，每个浓度测定3次，取平均值。当CCU含量为0时将培养物以16000r/min离心30min，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于牛支原体甲醛灭活疫苗的制备方法。

【技术特征摘要】
1.一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于牛支原体甲醛灭活疫苗的制备方法。2.如权利要求1所述的牛支原体甲醛灭活疫苗的制备方法，其特征在于牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件，牛支原体灭活疫苗免疫剂量，牛支原体灭活疫苗的免疫方式，牛支原体灭活疫苗使用的佐剂。3.如权利要求2所述的牛支原体灭活疫苗的制备的甲醛灭活条件，其特征在于牛支原体菌株的培养时间，甲醛的使用剂量，甲醛灭活时间：将冻存的M.bovis菌株复苏后，接种到M.bovis液体培养基，在一定条件下进行培养，3～4d后传代，测出第四代M.bovis培养物中CCU含量，按一定比例浓缩后得到1.0×1010ccu/ml的M.bovis培养物备用，在培养物中加入甲醛（分析纯）使其终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%，充分混合后在同样的条件下培养，每隔12h测定M.bovisCCU含量，每个浓度测定3次，取平均值；当CCU含量为0时将培养物以16000r/min离心30min，将得到的沉淀用0.1mol/L的PBS洗涤3次，然后以1:10在液体培养基中盲传3代同时接种固体培养基观察灭活效果。4.如权利要求2所述的牛支原体灭活疫苗免疫剂量，其特征在于选择牛支原体免疫剂量选择：将12～16只试验动物分为A、B、C、D4组，每组3～4只（雌雄搭配，体重搭配），以免疫前一天记为0d，在实验第1d用试验三中保存的未加佐剂1.0×1010CCU/ml的疫苗通过肌注的方式对A、B、C组试验动物进行免疫，A组1ml/只，B组2ml/只，C组3ml/只；第15d时以同样的方式和剂量进行加强免疫，D组不做任何处理为阴性对照；从0d起每隔10d颈静脉采血，连续7次，每次采血1ml以30...

【专利技术属性】
技术研发人员：何生虎，郭亚男，雷元元，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：宁夏,64