一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该细胞培养液每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1‑20 mg、枸杞多糖5‑20 mg、云芝多糖2‑20 mg、亚硒酸钠0.1‑1 mg、胰岛素生长因子1‑20 ug。本发明专利技术具有以下有益效果：本发明专利技术所使用的Vero细胞培养液添加剂，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高Vero细胞生长速度；增强IBDV对Vero细胞的敏感性，提高了TCID50含量；由本发明专利技术所使用的Vero细胞培养液还可以大幅度提高鸡传染性法氏囊活疫苗免疫原性。
Vero cell culture liquid additive, preparation method and using method thereof
The invention relates to an additive for Vero cell culture fluid, a preparation method and a use method thereof, belonging to the technical field of veterinary biological products. The cell culture medium per 1000ml PBS solution contains the following components: 1 mg 20 PTE, 5 20 Lycium barbarum polysaccharide mg, polysaccharide 2 20 mg, sodium selenite 0.1 1 mg, insulin-like growth factor 1 20 ug. The invention has the following advantages: the invention of the Vero cell culture liquid additives, greatly reduced the amount of serum, reduce the cost of cell culture; increase the growth rate of Vero cells; enhance the sensitivity of IBDV to Vero cells, increased the content of TCID50; used by the invention of the Vero cell culture medium can also greatly improve the infectious bursal disease vaccine immunogenicity.
【技术实现步骤摘要】
一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法。
技术介绍
非洲绿猴肾细胞系Vero细胞为全球认可的生产人用及动物用疫苗的细胞基质，基于其对多种病毒敏感的特性，Vero细胞的规模化培养技术在病毒性疫苗、重组蛋白、单克隆抗体等生产技术平台中具有重要的价值。鸡传染性法氏囊病（infectiousbursal,IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（infectiousbursalvirus,IBDV）引起的一种烈性传染病，该病主要通过疫苗来防控，疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程，鸡传染性法氏囊疫苗通常是大规模培养细胞收获病毒液，但目前多采用含血清的培养基培养细胞，血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。由使用血清所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。无血清培养基具有诸多优势：简化下游目的产物的分离纯化、节约成本；避免血清批次间的差异巧性，提高细胞培养的稳定性及结果的可靠性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；无血清培养基由于添加成分相对确定，可用于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等研究。专利技术内容针对现有技术存在的问题，本专利技术目的在于设计提供一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法的技术方案。所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1-20mg、枸杞多糖5-20mg、云芝多糖2-20mg、亚硒酸钠0.1-1mg、胰岛素生长因子1-20ug。所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：龟板提取物5-15mg、枸杞多糖8-16mg、云芝多糖4-16mg、亚硒酸钠0.2-0.8mg、胰岛素生长因子5-15ug。所述的一种Vero细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于将所述重量配比的组分混合后，加入到PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。所述的一种Vero细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按药物混合液：DMEM重量比=1:1~1:3将两者充分混合后使用。本专利技术中龟板提取物购买于：安徽远徽药业有限公司；枸杞多糖购买于：荆州金海药业有限公司；云芝多糖购买于：武汉福鑫化工有限公司；亚硒酸钠购买于：河南博特尔化工产品有限公司；胰岛素生长因子购买于：Sigma。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术所制备的Vero细胞培养液添加剂，可替代血清，大幅度降低生产成本，保证了疫苗的质量和安全性。2、本专利技术所制备的Vero细胞培养液添加剂，可以大大提高细胞的生长速度。3、本专利技术所制备的Vero细胞培养液添加剂，可以促进鸡传染性法氏囊病毒对Vero细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而提高鸡传染性法氏囊活疫苗的免疫原性。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。实施例1：培养液添加剂的制备龟板提取物：1mg(购买于：安徽远徽药业有限公司)枸杞多糖：5mg（购买于：荆州金海药业有限公司）云芝多糖：2mg(购买于：武汉福鑫化工有限公司)亚硒酸钠：0.1mg(购买于：河南博特尔化工产品有限公司)胰岛素生长因子：1ug(购买于：Sigma)将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM=1:1制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。实施例2：培养液添加剂的制备龟板提取物：8mg(购买于：安徽远徽药业有限公司)枸杞多糖：15mg（购买于：荆州金海药业有限公司）云芝多糖：8mg(购买于：武汉福鑫化工有限公司)亚硒酸钠：0.5mg(购买于：河南博特尔化工产品有限公司)胰岛素生长因子：8ug(购买于：Sigma)将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM=1:2制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。实施例3：培养液添加剂的制备龟板提取物：20mg(购买于：安徽远徽药业有限公司)枸杞多糖：20mg（购买于：荆州金海药业有限公司）云芝多糖：20mg(购买于：武汉福鑫化工有限公司)亚硒酸钠：1mg(购买于：河南博特尔化工产品有限公司)胰岛素生长因子：20ug(购买于：Sigma)将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM=1：3制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。试验例1本专利技术培养液添加剂的应用1材料1.1Vero细胞培养液添加剂按本专利技术实施例1-3制得1.2DMEM基础培养基、胎牛血清购于GIBCO公司，硫乙醇酸盐培养基(TG)、胰酪蛋白胨培养基（TSB）购于北京中海生物科技有限公司1.3Vero细胞购于ATCC，由浙江美保龙生物技术有限公司保存1.4鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株），购于中国兽医药品监察所1.5试验动物14日龄SPF鸡60只，购于青岛易邦生物技术有限公司实验动物中心2方法2.1培养基检验2.1.1无菌检验将实施例1-3制备的Vero细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行无菌检验，每个批次分别取1ml接种于2支50mlTG大管中，1支置于35-37℃培养，1支置于23-25℃培养，3d后各吸取培养物分别接种于10个TG小管，再分别置于35-37℃和23-25℃培养，另外每个批次分别取0.2ml接种于TSB小管内，置于23-25℃培养，同时做阴性对照，均培养7日，观察结果。2.1.2内毒素测定将实施例1-3制备的Vero细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行内毒素检验，每个批次分别取1.7ml用鲎试剂盒分别进行检测，用酶标仪选择波长405nm测其OD值，同时做阴性对照。2.2细胞生长速度测定由实施例1-3使用的Vero细胞培养液添加剂，以及含8%、10%胎牛血清的Vero完全培养液分别将已消化好的Vero细胞，稀释成3*104个/ml的细胞密度接种于24孔培养板，每孔培养液体积为2mL，每种培养基接种1块24孔培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养2d后，用0.25%(w/v)的胰蛋白酶溶液消化用不同培养液培养的Vero细胞细胞各4个培养孔，用CedexAS-20细胞密度和活力自动分析仪计数细胞密本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1‑20 mg、枸杞多糖5‑20 mg、云芝多糖2‑20 mg、亚硒酸钠0.1‑1 mg、胰岛素生长因子1‑20 ug。
【技术特征摘要】
1.一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1-20mg、枸杞多糖5-20mg、云芝多糖2-20mg、亚硒酸钠0.1-1mg、胰岛素生长因子1-20ug。2.如权利要求1所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000mlPBS溶液中含有以下组分：龟板提取物5-15mg、枸杞多糖8-16mg、云芝多糖4-16mg、亚...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，张秀文，李阳，施杏芬，冷春青，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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