一种卵黄免疫球蛋白的提取方法技术

一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，包括：原料处理、除脂、絮凝沉淀、过滤浓缩、盐析、离子交换层析纯化、微滤和干燥，得IgY冻干粉。本发明专利技术方法操作简便，结合了低温絮凝沉淀、超滤、盐析沉淀和离子交换层析技术手段提高了卵黄免疫球蛋白的纯度，整个过程无有机溶剂参与，产品安全性高，而且产生的副产品蛋清粉和蛋黄粉也可以应用于食品领域，提高了资源利用率。

Method for extracting yolk immune globulin

The invention discloses a method for extracting yolk immunoglobulin, comprising: raw material treatment, degreasing, flocculation, sedimentation, filtration, concentration, salting out, ion exchange chromatography purification, microfiltration and drying, and obtaining IgY freeze-dried powder. The method of the invention has the advantages of simple operation, low temperature combined with flocculation precipitation, ultrafiltration, salting out precipitation and ion exchange chromatography technique to improve the purity of IgY, the whole process without organic solvent, product safety, and the byproduct of the egg white powder and egg yolk powder can also be applied to the field of food, improve resource utilization the rate of.

【技术实现步骤摘要】
一种卵黄免疫球蛋白的提取方法
本专利技术属于生物制品及分离
，具体涉及一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。
技术介绍
在免疫学领域把由鸡卵黄中获得的抗体称为卵黄免疫球蛋白（ImmunoglobulinofYolk，IgY），是产蛋母鸡受免疫刺激后产生免疫反应，在输卵管内卵黄成熟期血液中的IgG被选择性地转移到卵黄中唯一的免疫球蛋白类物质，主要应用于疾病的诊断检测和防治、兽医临床、食品添加剂及化妆品领域等。目前，从鸡卵黄中分离纯化IgY的主要方法包括：（1）通过水稀释法、有机溶剂抽提法、天然胶法等以获取含IgY的水溶性组分（WSF）；（2）通过有机物或无机物沉淀法、高分子聚合物沉淀法、离子交换色谱法等对IgY进行分离纯化。但是，现有的提取和纯化技术获得的IgY产品中往往存在有机物残留或含有加多的杂蛋白，纯度不高的问题，而且在整个提取过程中还会丢弃一些有附加值的物质，造成资源浪费。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出了一种产品纯度高、易于保存和运输的卵黄免疫球蛋白的提取方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特点是，包括如下步骤：（1）原料处理：取新鲜鸡蛋，纯水浸泡25~30min后，用次氯酸钠消毒液消毒，再用纯水去除残留消毒液，沥干备用；（2）除脂：取经步骤（1）处理得到的鸡蛋，分离卵清和卵黄，去除卵黄膜，得卵黄液，按重量比卵黄液：超纯水=1:7~15向卵黄液中加入0~4℃的超纯水，混匀，得卵黄稀释液；卵黄稀释液用食品酸度调节剂调pH至5.0~7.0，搅拌30~40min，于0~4℃静置8~15h后，0~4℃以6000~8000rpm离心35~40min，得沉淀物和上清液，取上清液备用；取蛋清和离心得到的沉淀物，分别经喷雾干燥，得蛋清粉和蛋黄粉；（3）絮凝沉淀：在冰水浴条件下，向步骤（2）得到的上清液中边搅拌边依次加入质量浓度为0.8~1.5%的海藻酸钠水溶液和质量浓度为17~22%的氯化钙水溶液，其中，海藻酸钠水溶液的添加量为所述上清液体积的0.6~0.9%，氯化钙水溶液的添加量为所述上清液体积的0.24~0.32%，再用食品酸度调节剂调pH至4.5~8.5，搅拌30~50min，静置0.5~1h以产生絮凝，得絮凝液；（4）过滤浓缩：用板框过滤器除去絮凝液中的絮凝物，过滤压力控制在0.6~0.8MPa，得粗滤液；粗滤液采用超滤膜进行过滤浓缩，得浓缩截留液；其中，超滤膜的截留分子量为30~100KD，超滤温度5~15℃，操作压力0.1~0.3MPa，超滤膜选自醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、改性聚砜膜或聚偏氟乙烯膜；（5）盐析：向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的16%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的37%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的40%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得三次上清液；向三次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；或向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；所述的低温离心条件为：0~4℃以8000~12000rpm离心10~15min；（6）纯化：采用离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白粗提物进行纯化，得纯化后的卵黄免疫球蛋白溶液；（7）微滤、干燥：用微滤膜孔径大小为0.22μm的微滤器对经步骤（6）处理得到的卵黄免疫球蛋白溶液进行过滤除菌，冷冻干燥，得IgY冻干粉。本专利技术所述的卵黄免疫球蛋白的提取方法中，进一步优选的技术方案或者技术特征是：1、在步骤（1）中：所述的鸡蛋为普通蛋鸡或经特定抗原免疫蛋鸡所产的新鲜鸡蛋，特定抗原为常见的人体致病菌或病毒培养提纯达到一定数量级，经灭活或裂解灭活作抗原，加上免疫佐剂，对15-20周龄健康蛋鸡进行3-6次免疫注射。2、在步骤（2）和步骤（3）中：所述的食品酸度调节剂为醋酸、乳酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、碳酸钠中的一种。3、在步骤（4）中：所述的板框过滤器的相邻滤板间由吸附于滤布或纸板表面的食品级600~800目硅藻土作为过滤膜，硅藻土用量为1.5~2kg/m2过滤面积，同时，絮凝液中加入0.4~0.8%的食品级600~800目硅藻土作为助滤剂。4、在步骤（5）中：所述的盐析盐选自硫酸铵，硫酸镁，硫酸钠，氯化钠，磷酸钠。5、在步骤（5）中：所述的低温离心条件为：4℃以12000rpm离心10min。6、在步骤（6）中：所述的离子交换层析法的具体操作方法如下：将卵黄免疫球蛋白粗提物用平衡缓冲液溶解，得样品溶液，上样至预先用平衡缓冲液平衡好的DEAE-SephadexA-50柱，上样后仍以平衡缓冲液平衡，再采用阶段洗脱法，收集洗脱峰，得纯化后的卵黄免疫球蛋白溶液；所述平衡缓冲液是浓度为0.04~0.06mol/L、pH为7.0~7.3的磷酸盐缓冲液，所述阶段洗脱为依次用pH均为7.0~7.3、浓度分别为0.13~0.14mol/L和0.18~0.19mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱。进一步优选地，所述的平衡缓冲液是浓度为0.05mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液，所述阶段洗脱为依次用pH均为7.0、浓度分别为0.135mol/L和0.185mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱。7、在步骤（6）中：所述的离子交换法的具体操作方法如下：将卵黄免疫球蛋白粗提物用平衡缓冲液溶解，得样品溶液，上样至预先用平衡缓冲液平衡好的填充有羧甲基纤维素的层析柱，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，即得纯化后的卵黄免疫球蛋白溶液；所述平衡缓冲液为浓度为0.15~0.25mol/L、pH为4.8~5.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为浓度为0.15~0.25mol/L、pH为6.3~6.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。进一步优选地，所述的平衡缓冲液是浓度为0.2mol/L、pH为5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液是浓度为0.2mol/L、pH为6.4的柠檬酸-磷酸盐缓冲液。本专利技术方法与现有技术相比，在通过水稀释法除去卵黄中的脂类物质时，保持溶液温度在4℃以下，可以避免卵黄在搅拌过程中发生乳化现象，有利于后续对卵黄免疫球蛋白的提取。利用絮凝沉淀法，将海藻酸钠和氯化钙作为复合絮凝剂，共同作用于卵黄水溶性组分，去除其中的杂蛋白，去除效果好。再将无机盐沉淀法与离子交换层析法相结合，得到进一步纯化的卵黄免疫球蛋白，使得最终提取得到的产品的纯度达到85%，产品的微生物指标为总菌数小于2000CFU，而且整个工艺流程均在低温下进行，最大程度的保证了产品的生物活性。本专利技术方法操作简便，结合了低温絮凝沉淀、超滤、盐析沉淀和离子交换层析技术手段提高了卵黄免疫球蛋白的纯度，整个过程无有机溶剂参与，产品安全性高，而且产生的副产品蛋清粉和蛋黄粉也可以应用于食品领域，提高了资源利用率。附图说明图1为本专利技术实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）原料处理：取新鲜鸡蛋，纯水浸泡25~30min后，用次氯酸钠消毒液消毒，再用纯水去除残留消毒液，沥干备用；（2）除脂：取经步骤（1）处理得到的鸡蛋，分离卵清和卵黄，去除卵黄膜，得卵黄液，按重量比卵黄液：超纯水=1:7~15向卵黄液中加入0~4℃的超纯水，混匀，得卵黄稀释液；卵黄稀释液用食品酸度调节剂调pH至5.0~7.0，搅拌30~40min，于0~4℃静置8~15h后，0~4℃以6000~8000rpm离心35~40min，得沉淀物和上清液，取上清液备用；取蛋清和离心得到的沉淀物，分别经喷雾干燥，得蛋清粉和蛋黄粉；（3）絮凝沉淀：在冰水浴条件下，向步骤（2）得到的上清液中边搅拌边依次加入质量浓度为0.8~1.5%的海藻酸钠水溶液和质量浓度为17~22%的氯化钙水溶液，其中，海藻酸钠水溶液的添加量为所述上清液体积的0.6~0.9%，氯化钙水溶液的添加量为所述上清液体积的0.24~0.32%，再用食品酸度调节剂调pH至4.5~8.5，搅拌30~50min，静置0.5~1h以产生絮凝，得絮凝液；（4）过滤浓缩：用板框过滤器除去絮凝液中的絮凝物，过滤压力控制在0.6~0.8MPa，得粗滤液；粗滤液采用超滤膜进行过滤浓缩，得浓缩截留液；其中，超滤膜的截留分子量为30~100KD，超滤温度5~15℃，操作压力0.1~0.3MPa，超滤膜选自醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、改性聚砜膜或聚偏氟乙烯膜；（5）盐析：向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的16%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的37%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的40%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得三次上清液；向三次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；或向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；所述的低温离心条件为：0~4℃以8000~12000rpm离心10~15min；（6）纯化：采用离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白粗提物进行纯化，得纯化后的卵黄免疫球蛋白溶液；（7）微滤、干燥：用微滤膜孔径大小为0.22μm的微滤器对经步骤（6）处理得到的卵黄免疫球蛋白溶液进行过滤除菌，冷冻干燥，得IgY冻干粉。...

【技术特征摘要】
1.一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）原料处理：取新鲜鸡蛋，纯水浸泡25~30min后，用次氯酸钠消毒液消毒，再用纯水去除残留消毒液，沥干备用；（2）除脂：取经步骤（1）处理得到的鸡蛋，分离卵清和卵黄，去除卵黄膜，得卵黄液，按重量比卵黄液：超纯水=1:7~15向卵黄液中加入0~4℃的超纯水，混匀，得卵黄稀释液；卵黄稀释液用食品酸度调节剂调pH至5.0~7.0，搅拌30~40min，于0~4℃静置8~15h后，0~4℃以6000~8000rpm离心35~40min，得沉淀物和上清液，取上清液备用；取蛋清和离心得到的沉淀物，分别经喷雾干燥，得蛋清粉和蛋黄粉；（3）絮凝沉淀：在冰水浴条件下，向步骤（2）得到的上清液中边搅拌边依次加入质量浓度为0.8~1.5%的海藻酸钠水溶液和质量浓度为17~22%的氯化钙水溶液，其中，海藻酸钠水溶液的添加量为所述上清液体积的0.6~0.9%，氯化钙水溶液的添加量为所述上清液体积的0.24~0.32%，再用食品酸度调节剂调pH至4.5~8.5，搅拌30~50min，静置0.5~1h以产生絮凝，得絮凝液；（4）过滤浓缩：用板框过滤器除去絮凝液中的絮凝物，过滤压力控制在0.6~0.8MPa，得粗滤液；粗滤液采用超滤膜进行过滤浓缩，得浓缩截留液；其中，超滤膜的截留分子量为30~100KD，超滤温度5~15℃，操作压力0.1~0.3MPa，超滤膜选自醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、改性聚砜膜或聚偏氟乙烯膜；（5）盐析：向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的16%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的37%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的40%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得三次上清液；向三次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；或向浓缩截留液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得一次上清液；向一次上清液中加入其3~5倍体积的33%饱和盐析盐溶液，低温离心弃沉淀，得二次上清液；向二次上清液中加入其3~5倍体积的50%饱和盐析盐溶液，低温离心弃上清液，收集沉淀，即得卵黄免疫球蛋白粗提物；所述的低温离心条件为：0~4℃以8000~12000rpm离心10~15min；（6）纯化：采用离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白粗提物进行纯化，得纯化后的卵黄免疫球蛋白溶液；（7）微滤、干燥：用微滤膜孔径大小为0.22μm的微滤器对经步骤（6）处理得到的卵黄免疫球蛋白溶液进行过滤除菌，冷冻干燥，得IgY冻干粉。2.根据权利要求1所述的卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于，在步骤（1）中：所述的鸡蛋为普通蛋鸡或经特定抗原免疫蛋鸡所产的新鲜...

【专利技术属性】
技术研发人员：付强，
申请(专利权)人：尤丽康江苏生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32