脂蛋白a的酶联免疫试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.0。

【技术实现步骤摘要】
脂蛋白a的酶联免疫试剂盒及其制备方法
本专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测磷酸化脂蛋白(a)的酶联免疫试剂盒及其制备方法。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosisAS)是指有动脉壁增厚、变硬及弹性降低,并以动脉内膜形成粥样斑块为特征的病变。目前对于其发病原因尚未完全确定,可能与年龄、性别、血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病、肥胖、感染等因素有关。高胆固醇浓度,脂蛋白a是AS的一个主要的危险因子。脂蛋白(a)是人血浆中的一类特别的脂蛋白颗粒，最早由KareBerg于1963年发现，主要由低密度脂蛋白颗粒和富含糖链的高度亲水的apo(a)组成；其中每个apo(a)分子通过一个二硫键和一分子的apoB-100共价交联。Apo(a)由三个完全不同的结构组成：未激活的蛋白酶区域、一个拷贝的K5环饼和多拷贝的K4环饼区。研究表明，人血浆中Lp(a)浓度的升高与心血管功能的紊乱及脑血管疾病相关，血浆中Lp(a)浓度的升高通常预示着早期的冠状动脉和梗阻风险的增加，同时由于Lp(a)基本浓度具有高度的遗传性，因此，Lp(a)是早期冠心病(CHD)的重要预示因子，对其进行检测对于心血管疾病的预测具有重要意义。目前，已知的检测脂蛋白(a)浓度的方法有免疫比浊法、放射免疫法、荧光免疫测定法等检测方法，但上述测定方法的操作比较复杂，检测用时长或者灵敏度较低等缺点，不适合做常规检测。
技术实现思路
本专利技术的第一方面是提供一种脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。所述脂蛋白a系列标准品的脂蛋白a含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/LPBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有5gBSA和10g蔗糖。所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0。所述稀释液为50mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；所述洗涤液为50mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的5％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.5mg/ml；所述终止液为3mol/L硫酸。本专利技术的第二方面是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.0的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗脂蛋白a单克隆抗体稀释到10μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗脂蛋白a单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；c、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含重量百分比为0.1％的甘油单蓖麻油酸酯、0.5％的BSA和1％蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300μl/孔，室温，1小时；d、真空干燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板。(2)酶标记抗体溶液制备：a、将10mgHRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；b、加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；c、加入含5mg抗脂蛋白a抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；d、吸出透析袋内溶液，加入0.5mlNaBH4,4℃下放置2小时；e、滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；f、上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.2mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；g、吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过葡聚糖层析柱，用0.2mol/LpH7.4的PBS洗脱，收集洗脱液，即为纯化的酶标记抗体；h、将收集的酶标记抗体除菌过滤，配制成酶标记抗体溶液，具体为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0。(3)标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液，按照本领域常规的溶液配制方法制备。具体实施方式下面将进一步的来举例说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.0的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗脂蛋白a单克隆抗体稀释到10μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗脂蛋白a单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；c、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含重量百分比为0.1％的甘油单蓖麻油酸酯、0.5％的BSA和1％蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300μl/孔，室温，1小时；d、真空干燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板。(2)酶标记抗体溶液制备：a、将10mgHRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；b、加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；c、加入含5mg抗脂蛋白a抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；d、吸出透析袋内溶液，加入0.5mlNaBH4,4℃下放置2小时；e、滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；f、上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.2mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；g、吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过葡聚糖层析柱，用0.2mol/LpH7.4的PBS洗脱，收集洗脱液，即为纯化的酶标记抗体；h、将收集的酶标记抗体除菌过滤，配制成酶标记抗体溶液，具体为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0。(3)标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液，按照本领域常规的溶液配制方法制备。所述步骤1和2所采用的抗脂蛋白a抗体为配对的单克隆抗体，所述抗体购自上海康朗生物科技公司。所述脂蛋白a系列标准品的脂蛋白a含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/LPBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有5gBSA和10g蔗糖。所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0。所述稀释液为50mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；所述洗涤液为50m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。

【技术特征摘要】
1.一种脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂蛋白a系列标准品的脂蛋白a含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/LPBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有5gBSA和10g蔗糖。3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0。4.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为50mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；所述洗涤液为50mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。5.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的5％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠。6.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.5mg/ml；所述终止液为3mol/L硫酸。7.一种权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.0的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗脂蛋白a单克隆抗体稀释到10μg/ml，得包被液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44