一种胰腺癌药物耐受性的检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种胰腺癌药物耐受性的检测方法和试剂盒，miR‑584、miR‑153、miR‑188和miR‑483在胰腺癌耐药组织样本中相比于胰腺癌正常组织样本中显著高表达，可作为胰腺癌药物耐受性筛选标志物，对临床患者提供准确的临床用药指导；本发明专利技术的胰腺癌药物耐受性miRNA检测试剂盒是以miR‑584、miR‑153、miR‑188和miR‑483联合使用作为胰腺癌药物耐受性检测指标，基于荧光实时定量PCR的检测试剂盒；可快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，满足绝大多数胰腺癌药物耐受性的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种胰腺癌药物耐受性的检测方法和试剂盒
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种胰腺癌药物耐受性的检测方法和试剂盒。
技术介绍
非编码RNA是指经过基因组转录但不翻译成蛋白质的RNA，其中microRNA(miRNA)是一类具有进化保守性的小分子非编码RNA，广泛存在动物、植物及病原微生物中。miRNA基因经RNA聚合酶II或III转录，产生长度为数百到数千个核苷酸的原始miRNA转录本(PrimarymiRNA)，然后分别在核内和胞浆经两个RNaseIII家族酶Drosha和Dicer两步加工，生成长度为22个核苷酸左右的成熟miRNA。在装配到效应复合物RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)后，miRNA通过碱基配对将RISC定位到靶mRNA上，引发靶mRNA的翻译抑制或(和)降解，在转录后水平负调控靶基因的表达，目前已在人类基因组中鉴定出1000多个miRNA，有超过30％的基因受到miRNA调节。大量证据表明，miRNA与细胞凋亡、分化、干细胞干性维持等相关，同时发现约200多种miRNA与多种人类重大疾病发生密切相关，如癌症、神经退行性、病毒性疾病。研究表明，药物耐受性是恶性肿瘤除侵袭转移外的另一重要特征，药物耐受性肿瘤具有恶性程度高、发展快、发现晚、病程短、转移早、预后差等特点。作为“癌中之王”，胰腺癌具有高转移性、预后差和存活率低等特点；流行病学调查发现，仅有约24％胰腺癌病人能存活1年及1年以上，而5年及5年以上病人存活率不到5％。同时，胰腺癌的另一个突出特征是极易发生耐药性。目前gemcitabine(Gemzar，健择)是治疗胰腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌等晚期癌症的有效药物之一，但在临床用药过程中发现胰腺癌病人易对gemcitabine产生耐药性。药物耐受性的获得导致癌细胞恶性程度增强，癌症药物敏感性降低。耐药性引起癌细胞恶化机制复杂多样，包括癌细胞干性诱导或加强、肿瘤干细胞筛选、癌细胞通过膜转运蛋白把药物泵出细胞、癌细胞加强抗凋亡作用以及癌细胞增强解毒机制等。对于恶性癌症，EMT(epithelial-mesenchymaltransition，上皮-间充质细胞转换)已成为诱导癌细胞获得干性、进而增强耐药性的一个重要原因，而化疗药物筛选肿瘤干细胞则是另一个不容忽视的因素，两者共同作用使得肿瘤杀而不绝。有证据表明，癌细胞通过膜转运蛋白把药物泵出细胞以及癌细胞加强抗凋亡作用在癌细胞耐药性形成中起着极重要的作用，也是目前所了解的主要耐药形成机制。癌细胞减少药物在细胞内积累主要通过ABCtransporterfamily，如mdr-1和mrp-1等；以上耐药机制通过联合作用或者强化其中之一的方式，促进恶性癌细胞获得药物耐受性。目前药物耐受性已经成为胰腺癌治疗的一个关键阻碍因素。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在胰腺癌细胞易对药物健择产生耐药性的技术问题，提供一种胰腺癌药物耐受性的检测方法和试剂盒。为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：一种胰腺癌药物耐受性的检测方法，其特征在于，miR-584、miR-153、miR-188、miR-483联合使用，用做胰腺癌药物耐受性筛选标志物。优选地，所述胰腺癌药物耐受性的检测方法，方法采用RT-PCR反应体系和实时荧光定量PCR反应体系检测胰腺癌细胞中miR-584、miR-153、miR-188、miR-483的表达量之和；miR-584、miR-153、miR-188、miR-483在耐药胰腺癌细胞中相比于非耐药胰腺癌细胞中显著高表达。所述检测方法在胰腺癌药物耐受性检测试剂盒中应用。一种胰腺癌药物耐受性检测试剂盒，所述检测试剂盒包含检测miR-584、miR-153、miR-188、miR-483的检测体系，所述检测体系包括RT-PCR反应体系和实时荧光定量PCR反应体系。优选地，所述胰腺癌药物耐受性检测试剂盒的检测体系的引物包括miRNA检测的RT-PCR特异性引物，荧光定量PCR的正向引物和反向通用引物：其中，U6miRNA为内参。优选地，所述胰腺癌药物耐受性检测试剂盒中，用于配制所述实时荧光定量PCR反应体系的试剂包括SYBRGreen混合液、ROX校正液，正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所述RT-PCR反应体系的试剂包括RT-PCR特异性引物、多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水相对于现有技术，本专利技术的优点如下，本专利技术胰腺癌药物耐受性的检测方法，将miR-584、miR-153、miR-188和miR-483作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，在胰腺癌健择药物耐受性诊断指标方面具有突出优势；将这四个miRNAs分子标记物应用于胰腺癌获得性药物耐受性检测试剂盒的开发，通过快速、准确的qRT-PCR检测，实现胰腺癌药物耐受的辅助诊断，对临床患者提供准确的临床用药指导；本专利技术的胰腺癌药物耐受性检测试剂盒是以miR-584、miR-153、miR-188和miR-483联合使用作为胰腺癌药物耐受性检测指标，基于荧光实时定量PCR的检测试剂盒；可快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，满足绝大多数胰腺癌药物耐受性的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。附图说明图1是miR-584实时荧光定量PCR的(A)溶解曲线图和(B)扩增效率图；图2是miR-153实时荧光定量PCR的(A)溶解曲线图和(B)扩增效率图；图3是miR-188实时荧光定量PCR的(A)溶解曲线图和(B)扩增效率图；图4是miR-483实时荧光定量PCR的(A)溶解曲线图和(B)扩增效率图；图5是miR-584、miR-153、miR-188和miR-483单指标检测的ROC曲线图；图6是miR-584、miR-153、miR-188和miR-483联合检测的ROC曲线图；图7是胰腺癌健择耐药相关miRNA标志物筛选实验数据图：(A)高通量测序结果中显著差异表达的miRNAs，(B)通过qRT-PCR技术，对高通量测序结果中差异miRNA进行验证，(C)8个差异表达的miRNAs，(D)通过qRT-PCR技术，利用胰腺癌健择药物耐受性组织样本进行miRNA检测(n＝30)。具体实施方式实施例1：胰腺癌临床药物健择耐药细胞系获得选用胰腺癌标准化疗药物gemcitabin(Gemzar)对胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaCa-2进行耐药细胞株筛选。经过药物剂量递加筛选方法，获得了可分别在56.4μM、15.0μMGemzar存活的PANC-1、MIAPaCa-2耐药细胞株。半致死抑制浓度(IC50)分析显示，耐药细胞系PANC-1-R和MIAPaCa-2-R相比药物敏感细胞系其IC50分别被提高了121倍和6倍。相关耐药蛋白表达的提高是癌症获得药物耐受性的关键因素，比如MRP1、MDR1在多数癌症的药物耐受性获得中不同程度被上调。因此，我们进一步检测PANC-1-R(PR)、MIAPaCa-2-R(MR)耐药蛋白变化情况。通过westernblot检测显示，耐药蛋白MRP1、MDR1的表达在PANC-1-R、MIAPaCa-2-R中被上调。同样通过细胞免疫荧光(immunofluore本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰腺癌药物耐受性的检测方法，其特征在于，miR‑584、miR‑153、miR‑188、miR‑483联合使用，用做胰腺癌药物耐受性筛选标志物。

【技术特征摘要】
1.一种胰腺癌药物耐受性的检测方法，其特征在于，miR-584、miR-153、miR-188、miR-483联合使用，用做胰腺癌药物耐受性筛选标志物。2.如权利要求1所述的胰腺癌药物耐受性的检测方法，其特征在于，所述方法采用RT-PCR反应体系和实时荧光定量PCR反应体系检测胰腺癌细胞中miR-584、miR-153、miR-188、miR-483的表达量之和。3.如权利要求1或2所述的检测方法在胰腺癌药物耐受性检测试剂盒中应用。4.一种胰腺癌药物耐受性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含检测如权利要求1所述的胰腺癌药物耐受性筛选标志物的检测体系，所述检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺小宏，王延宾，袁鹏，王鑫，张承武，李林，
申请(专利权)人：南京北恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32