制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用酵母菌制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。本发明专利技术提供的方法包括以下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白。本发明专利技术制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体具有聚体结构且拥有糖基化修饰，因而其具有作为埃博拉出血热预防用疫苗的潜质。

【技术实现步骤摘要】
制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法，特别涉及一种用酵母菌制备具有聚体结构和糖基化修饰的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。
技术介绍
埃博拉病毒是一种单股负链的RNA病毒，基因组全长大约19K，全基因组可编码NP，VP35，VP40，GP，VP30，VP24和L蛋白7种蛋白质。其中VP40基质蛋白是埃博拉病毒基质中丰度最高的蛋白质，其主要作用是参与病毒骨架的形成，在病毒在宿主细胞中的组装及释放过程中VP40基质蛋白发挥重要作用，其主要的特点就是可以发生自体寡聚化作用，且二聚体是其寡聚作用的基础单元。埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP是病毒粒子唯一的表面蛋白，在病毒入侵的过程中发挥着重要的作用，同时也是中和抗体主要的作用靶标。EBOV-GP蛋白是一个高度糖基化修饰的蛋白，其糖基化修饰主要集中在GlycanCap和mucinlikedomain(MLD)两个区域，GlycanCap和MLD覆盖于GP蛋白的表面，与病毒粒子的躲避免疫系统的攻击相关，在病毒入侵的过程中由组织蛋白酶B/L切除GlycanCap和MLD两个高度糖基化修饰的糖帽暴露其受体结合区(RBD)，从而介导病毒的入侵。GP蛋白由GP1和GP2两个亚基构成，GP2亚基的主要功能是跨膜、内部融合肽介导与宿主膜融合以及GP蛋白三聚体的形成，GP1亚基主要由信号肽序列SP、RBD、GlycanCap和MLD构成。目前，对于埃博拉病毒蛋白类疫苗的研究主要集中在基于埃博拉病毒糖蛋白GP的亚单位疫苗研究以及基于GP、VP40/GP、NP、VP40的病毒样颗粒疫苗研究，而对于将GP蛋白中相关保护性抗原区段与埃博拉病毒基质蛋白VP40融合表达的研究还未见报导。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备具有聚体结构和糖基化修饰的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。本专利技术中所述的埃博拉病毒糖蛋白均为埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)。本专利技术所提供的方法，可包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白。获得编码所述博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体基因的方法具体可为全基因合成法、PCR融合法或分片段缺失后片段融合法。其中，所述酵母可以为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母等。在本专利技术的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母GS115。其中，所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体基因可以是在苏丹型埃博拉病毒(SudanEbolavirus)GP蛋白基因和VP40基因、扎伊尔型埃博拉病毒(ZaireEbolavirus)GP蛋白基因和VP40基因、科特迪瓦型埃博拉病毒(Coted’IvoireEbolavirus)GP蛋白基因和VP40基因、本迪布焦埃博拉病毒(BundibugyoEbolavirus)GP蛋白基因和VP40基因、雷斯顿型埃博拉病毒(RestonEbolavirus)GP蛋白基因和VP40基因。当然，将本专利技术的方法用于与埃博拉病毒关系密切的马尔堡病毒(Marburgvirus)也属于本专利技术的保护范围。在步骤(2)中，进行所述培养的过程中，还包括向培养体系中加入体积百分比为0.5％的甲醇的步骤，目的是为了诱导所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的表达。每12小时加入一次甲醇，持续到72小时止。在步骤(2)中，进行所述破碎的方法可为物理方法、生物方法或化学方法。其中，所述物理方法具体可为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体可为酶消化裂解法；所述化学方法具体可为碱裂解法。在步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白的粗提液的步骤。其中，所述去污剂了为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂。所述离液剂具体可为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体可为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体可为脱氧胆酸盐；所述两性离子去污剂具体可为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-1-烷磺酸。在本专利技术的一个实施例中，具体为向破碎后的体系中加入终浓度为如下的各物质：8M尿素、50mMpH8.0的磷酸盐缓冲液、500mMNaCl、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油。在步骤(2)中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤。在本专利技术中，所述纯化具体为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析。其中，所述亲和层析介质具体可为ChelatingFastFlow或Ni-NTA；所述凝胶排阻层析介质具体可为SephadexG25、Superdex200或Superose6凝胶预装柱；所述离子交换层析具体可为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述阳离子交换层析介质具体可为SOURCE30S、SepharoseFastFlowSP或CMFastFlow；所述阴离子交换层析介质具体可为SOURCE30QFastFlow。在本专利技术的一个实施例中，进行所述亲和层析时，采用的介质具体为ChelatingFastFlow；采用的柱平衡液(A液)组成如下：6M尿素、500mMNaCl、50mMpH7.5的磷酸盐缓冲液、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(B液)组成如下：6M尿素、500mMNaCl、50mMpH7.5的磷酸盐缓冲液、500mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)5％所述B液和95％所述A液，(2)50％所述B液和50％所述A液，(3)100％所述B液，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)所在的梯度洗脱液为50％B洗脱液(即50％所述B液和50％所述A液)。在本专利技术一个实施例中，进行所述凝胶排阻层析时，采用的介质具体为SephadexG25；流动相组成如下：20mMpH6.5的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。在本专利技术的一个实施例中，进行的所述离子交换层析具体为阳离子交换层析，所采用的介质具体为SOURCE30S；采用的平衡液(A液)组成如下：20mMpH6.5的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(B液)组成如下：20mMpH6.5的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，和1MNaCl，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)15％所述B液和85％所述A液，(2)30％所述B液和70％所述A液，(3)50％所述B液和50％所述A液，(4)100％所述B液，(5)100％0.5MNaOH，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)主要所在的梯度洗脱液为15％B洗脱液(即15％所述B液和85％所述A液)。步骤(1)中，所述埃博拉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法，包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法，包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母；和/或所述博拉病毒为苏丹型埃博拉病毒、扎伊尔型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒、本迪布焦埃博拉病毒或雷斯顿型埃博拉病毒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行所述培养的过程中，包括向培养体系中加入甲醇诱导的步骤；和/或步骤(2)中，进行所述破碎的方法为物理方法、生物方法或化学方法；所述物理方法具体为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体为酶消化裂解法；所述化学方法具体为碱裂解法。和/或步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的粗提液的步骤；所述去污剂为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂；所述离液剂具体为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体为脱氧胆酸盐；所述两性离子去污剂具体为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-1-烷磺酸。和/或步骤(2)中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤；所述纯化为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析；所述亲和层析介质具体为ChelatingFastFlow或Ni-NTA；所述凝胶排阻层析介质具体为SephadexG25、Superdex200或Superose6凝胶预装柱；所述离子交换层析具体为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述阳离子交换层析介质具体为SOURCE30S、SepharoseFastFlowSP或CMFastFlow；所述阴离子交换层析介质具体为SOURCE30QFastFlow。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的氨基酸序列为如下(a1)-(a5)中任一：(a1)序列表中序列8的第33-637位；(a2)序列表中序列8的第33-649位；(a3)序列表中序列8的第1-637位；(a4)序列表中序列8的第1-649位；(a5)将(a1)-(a4)任一限定的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，吴慕胜，刘波，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，安徽大学，
类型：发明
国别省市：北京,11