一种花生组织的DNA快速提取方法技术

本发明专利技术属于DNA提取方法技术领域，具体涉及一种花生组织的DNA快速提取方法。包括材料预处理、DNA提取液研磨、加入β‑巯基乙醇和20g/100mL的SDS、65℃水浴加热、异丙醇沉淀、75％乙醇清洗等步骤。本发明专利技术的方法提取花生组织DNA耗时短、DNA纯度高，并且提取过程中不使用苯酚等挥发性有毒有机溶剂，减少有机溶剂对人体健康的损害，安全性高。

【技术实现步骤摘要】
一种花生组织的DNA快速提取方法
本专利技术属于DNA提取方法
，具体涉及一种花生组织的DNA快速提取方法。
技术介绍
花生一直是我国传统的农作物种植品种之一，也是主要的油料作物，花生种含有丰富的油酸和亚油酸，营养丰富，由花生制备而成的花生压榨油是人们的常用的食用油。传统的花生育种过程为自然杂交、自交或者转基因分子育种，分子育种首先涉及的就是花生DNA的提取，转化、转化体的鉴定筛选。大量的分子育种工作已经很繁杂，简便快速的DNA提取方法一直是广大科研工作者的需求。目前，由于花生组织包括根、茎、叶、种子等，干扰基因组DNA的提取的因子也很多，传统的基因组DNA提取方法包括CTAB和酚类法，这些方法提取DNA过程中，步骤操作繁琐、耗时，通常CTAB法制备提取DNA需要数小时甚至更长的时间，极大的浪费了时间资源。因此，有必要寻求一种快速的DNA的快速提取方法。
技术实现思路
本专利技术提供的一种花生组织的DNA快速提取方法，解决了传统的CTAB和酚类法提取基因组DNA，步骤操作繁琐、耗时的问题。本专利技术目的是提供一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：S1，材料预处理：采集花生组织，洗净晾干，交替置于-20℃5min和20℃5min，每个温度各两次，再次晾干，得到待测样品；S2，取待测样品，加入玻璃珠研磨至粉末状，然后加入DNA提取液研磨，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，离心，收集第一次上清液；其中，1LDNA提取贮藏液中含有0.1molTris-HCl、0.1molEDTA、1.5molNaCl、10gCTAB、pH8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL50mg/mL脂肪酶，作为DNA提取液使用；S3，向第一次上清液中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置≥20min的时间，离心，弃上清，收集DNA沉淀；S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇，离心，弃上清，最后置于通风处风干；S5，风干的DNA沉淀用TE溶解，-20℃保存备用。优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2中，所述脂肪酶为碱性脂肪酶或者中性脂肪酶。优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2中，待测样品、DNA提取液、β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS的比例为1g：2mL：50μL：20μL。优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2、S4中离心的条件均为4℃、12000rpm离心10min，S3中离心的条件均为4℃、12000rpm离心15min。优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2与S3之间还包括有机溶剂萃取步骤，具体为：S2中收集第一次上清液后，取第一次上清液转入新的离心管中，加入等体积的体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液，在4℃下12000rpm离心10min，收集第二次上清液；然后向第二次上清液中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇。优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S6中，风干的DNA沉淀用50μLpH8.0TE溶解，然后加入1μl10ng/μl的RNaseA，常温过夜后置于-20℃保存备用。与现有技术相比，本专利技术提供的一种花生组织的DNA快速提取方法，具有以下有益效果：1、适用于花生的根、茎、叶、花、种子等不同组织，DNA提取液中添加纤维素酶用于溶解植物中纤维素，添加脂肪酶用于溶解样品中脂肪，尤其是溶解花生种子中脂肪，使DNA更容易释放，提高DNA纯度；20g/100mL的SDS用于裂解细胞，β-巯基乙醇一方面具有抗氧化效果，另一方面，其与SDS联合使用，可以沉淀掉蛋白质，比单独使用SDS效果更佳，避免蛋白质对DNA纯度的影响。2、传统CTAB方法排除人为操作时间误差，提取植物DNA耗时120min以上，而本专利技术的方法取花生组织DNA耗时70min左右，耗时短、DNA纯度高，并且提取过程中不使用苯酚等挥发性有毒有机溶剂，减少有机溶剂对人体健康的损害，安全性高。附图说明图1为花生叶片基因组DNA的酶切电泳图谱；其中，1号泳道均为BamHⅠ酶切结果，2号泳道为KpnⅠ酶切结果，3号泳道为PstⅠ酶切结果，4号泳道为花生叶片基因组DNA。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及到数据范围的，在该数据范围内包括两个端点的任何数值均可实现，由于效果和步骤相同，故不赘述。实施例1一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：S1，材料预处理：采集根、茎、叶、花或者种子等花生组织，洗净晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5min，再置于20℃5min，最后再次晾干，得到待测样品。S2，取1g待测样品置于研磨中，加入玻璃珠研磨至粉末状，玻璃珠的直径Φ:0.4-0.6mm，然后加入2mLDNA提取液研磨5-10min，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入50μLβ-巯基乙醇和20μL20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，4℃、12000rpm离心10min，收集第一次上清液。其中，1LDNA提取贮藏液中含有0.1molTris-HCl、0.1molEDTA、1.5molNaCl、10gCTAB、pH8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL50mg/mL碱性脂肪酶，作为DNA提取液使用。S3，将第一次上清液转入新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，12000rpm离心15min，弃上清，收集DNA沉淀。S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇600μL，轻摇5min，以清洗DNA，12000rpm离心10min，弃上清，重复清洗步骤1次，最后置于通风处风干。S5，风干的DNA沉淀用50μLpH8.0TE溶解，然后加入1μl10ng/μl的RNaseA，常温过夜后置于-20℃冰箱保存备用。我们以花生种子为对象，利用实施例1的方法提取基因组DNA，图1为花生种子基因组DNA的酶切电泳图谱；其中，1号泳道均为BamHⅠ酶切结果，2号泳道为KpnⅠ酶切结果，3号泳道为PstⅠ酶切结果，4号泳道为花生叶片基因组DNA。各个泳道均可见清晰条带，说明本专利技术方法提取的DNA不会影响后续酶切、PCR等步骤。取2μl实施例1溶解的DNA溶液，在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD260/OD280值、OD260/OD230值来判断DNA的纯度，结果如表1所示。表1结果显示，采用实施例1的方法提取花生不同组织的DNA均具有较高的纯度。表1实施例1花生不同组织提取的DNA检测信息实施例2一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：S1，材料预处理：采集根、茎、叶、花或者种子等花生组织，洗净晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，材料预处理：采集花生组织，洗净晾干，交替置于‑20℃5min和20℃5min，每个温度各两次，再次晾干，得到待测样品；S2，取待测样品，加入玻璃珠研磨至粉末状，然后加入DNA提取液研磨，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入β‑巯基乙醇和20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，离心，收集第一次上清液；其中，1L DNA提取贮藏液中含有0.1mol Tris‑HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10g CTAB、pH 8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL 50mg/mL脂肪酶，作为DNA提取液使用；S3，向第一次上清液中加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，混匀，‑20℃放置≥20min的时间，离心，弃上清，收集DNA沉淀；S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇，离心，弃上清，最后置于通风处风干；S5，风干的DNA沉淀用TE溶解，‑20℃保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，材料预处理：采集花生组织，洗净晾干，交替置于-20℃5min和20℃5min，每个温度各两次，再次晾干，得到待测样品；S2，取待测样品，加入玻璃珠研磨至粉末状，然后加入DNA提取液研磨，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，离心，收集第一次上清液；其中，1LDNA提取贮藏液中含有0.1molTris-HCl、0.1molEDTA、1.5molNaCl、10gCTAB、pH8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL50mg/mL脂肪酶，作为DNA提取液使用；S3，向第一次上清液中加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置≥20min的时间，离心，弃上清，收集DNA沉淀；S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇，离心，弃上清，最后置于通风处风干；S5，风干的DNA沉淀用TE溶解，-20℃保存备用。2.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴继华，刘卫星，陈雷，范小玉，李可，张枫叶，姜曙光，贺群领，
申请(专利权)人：商丘市农林科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41