酰化的GLP-1衍生物制造技术

本发明专利技术提供了一种酰化的GLP‑1衍生物，尤其是涉及到GLP‑1(7‑37)多肽衍生物的脂肪酸修饰的缀合物。另外，本发明专利技术还提供了该肽缀合物的制备方法、含该肽缀合物的药物以及在制备药物中的用途和中间体等。

【技术实现步骤摘要】
酰化的GLP-1衍生物
本专利技术属于多肽
，具体而言，本专利技术涉及GLP-1(7-37)多肽类似物的脂肪酸修饰的缀合物。另外，本专利技术还涉及该肽缀合物的制备方法、含该肽缀合物的药物以及在制备药物中的用途和中间体等。
技术介绍
糖尿病是一种由遗传和环境等多种因素引起的糖代谢紊乱疾病，现已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三位重大疾病。糖尿病本身不一定造成危害，但长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍。为此治疗糖尿病进而预防其并发症是至关重要的社会问题。糖尿病由于患病机理不同可分为几种类型。其中绝大部分属于二型糖尿病(约90％)，主要是因体重过重和缺乏身体活动所致。II型糖尿病患者多存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足两方面异常，在发病的中晚期往往出现胰岛β细胞凋亡。目前，临床使用的口服降糖药的作用机理多为增强胰岛素敏感性，或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法解决β细胞凋亡这一难题。而胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物药物由于具有减缓β细胞凋亡，增进其再生，促使胰岛β细胞分化并增殖的作用，使其成为治疗II型糖尿病的研究重点。GLP-1是由回肠和结肠的L-细胞分泌的肠降血糖素。GLP-1的作用是以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素释放从而防止低血糖症发生。由于这种性质，其作用于2型糖尿病的潜在治疗而受到关注。然而，使用GLP-1作为治疗药剂的主要障碍是其在血浆中小于4分钟的极其短的半衰期。作为稳定肽并抑制它通过蛋白水解酶降解的方法，已经进行了一些实验来修饰对该蛋白水解酶敏感的特定氨基酸序列。由于GLP-1(7-37或7-36酰胺)通过二肽基肽酶IV(DPPIV)在第8位氨基酸(Ala)和第9位氨基酸(Asp)之间进行剪切而损失具有生物活性的GLP-1的药物浓度，因此具有减少血液中葡萄糖浓度以治疗2型糖尿病作用的GLP-1(7-37或7-36酰胺)具有4分钟或更短的生理活性半衰期(Kreymann等，1987)。因此，已经进行了各种关于具有抗DPPIV的GLP-1类似物的研究，并且已经进行了用Gly取代Ala(Deacon等，1998；Burcelin等，1999)或用Leu或D-Ala取代Ala(Xiao等，2001)的实验，从而保持它的活性的同时增加了对DPPIV的抗性。GLP-1的N末端氨基酸，His7对GLP-1的活性是重要的，并且作为DPPIV的目标。因此，美国专利第5545618号描述了用烷基或酰基修饰N末端，并且Gallwitz等描述了第7位His进行N甲基化或a甲基化，或者用整个His用咪唑取代来增加对DPP–IV的抗性并保持生理活性。除了这些修饰，从希拉毒蜥蜴的唾液腺纯化的GLP-1类似物exendin-4(美国专利第5424686号)具有对DPPIV的抗性并比GLP-1具有更高的生理活性。因此，它具有比GLP-1的半衰期更长的2至4小时的体内半衰期。然而，仅适用增加DPPIV抗性的方法，生理活性不能被充分地保持，并且在使用商业可获得的exendin-4(exenatide)的情况下，它需要一天两次被注射给病人，这对病人仍然是很痛苦的。这些促胰岛素肽具有一个问题，通常肽的大小很小，从而，它们不能在肾中被重新获得，并且它们随后被排出体外。因此，已经使用以化学方法在肽的表面添加例如聚乙二醇的具有高溶解度的聚合物来抑制在肾中的损失的方法。美国专利第692464号描述了PEG结合到exendin-4的赖氨酸残基来增加它的体内停留时间，然而，这种方法增加了PEG的分子量，从而增加了肽类药物的体内停留时间，同时随着分子量的增加，该肽类药物的浓度显著地减少，并且肽的反应性也降低了。因此，产量被不希望的降低了。此外，一系列其它不同方法也已经用于修饰胰高血糖素样肽-1化合物的结构以提供体内更长的作用持续时间。WO96/29342公开了其中亲本肽激素已经通过在C-端氨基酸残基或在N-端氨基酸残基引入亲脂性取代物而修饰肽激素衍生物。WO98/08871公开了其中亲本肽的至少一个氨基酸残基连接有亲脂性取代物的GLP-1衍生物(liraglutide)。WO99/43708公开了具有连接至C-端氨基酸残基的亲脂性取代物GLP-1(7-35)和GLP-1(7-36)衍生物。WO00/34331公开了双酰化的GLP-1类似物。WO00/69911公开了用于注射进患者中的活化的促胰岛素肽，据认为在患者中它们与血液成分反应形成缀合物，从而据说提供体内更长的作用持续时间。WO2006/097537公开了另一种酰化的GLP-1类似物(semaglutide)，通过将第8位氨基酸突变为非天然氨基酸，与WO98/08871的酰化的GLP-1(liraglutide)相比，具有更长的半衰期。国际专利公开第WO02/046227号申请描述了使用基因重组技术通过将GLP-1，exendin-4或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白区(Fc)结合来制备融合蛋白，这可以解决如聚乙二醇化产量低和非特异性的问题，但是它们仍然具有这样一个问题，即增加血液中半衰期的效果不像期待中的那么显著，并且有时候浓度也低。为了使增加血液中半衰期的效果最大化，使用了各种类型的肽连接器，但是可能引起免疫反应，在这其中就包括Val8Glu22-GLP-1(7-37)-Fc。目前市场上获批的GLP-1药物主要有从蜥蜴唾液中分离出的Exenatide-4，以及采用脂肪酸，抗体Fc段或血清白蛋白修饰的人源GLP-1类似物。Exenatide-4半衰期太短，仅2-4小时，一天需要至少两次注射。诺和诺德公司的脂肪酸修饰的利拉鲁肽在降血红蛋白糖基化及降体重方面最有效且副作用较少，但其不足方面是体内半衰期只有13小时，需要每天给药。为了进一步延长体内半衰期，减少给药频率，近年来进一步采用氨基酸序列突变和FC、脂肪酸或白蛋白等修饰的长效GLP-1类似物已经被陆续开发。如礼来公司的杜拉鲁肽和诺和诺德公司即将上市的索玛鲁肽。这些长效化的GLP-1类似物在人体内的半衰期可被进一步延长，可实现每周给药一次的给药频率。由于GLP-1类似物需要长期注射给药，所以更长效期的药物的开发将具有更好的患者依从性及更大的市场竞争力。另外现有技术的药物生产成本较高，售价高昂。现有技术中，通过Fc或脂肪酸的方式修饰而开发的长效GLP-1类似物，给药周期均被限定在1周或1周以内，本专利技术人独立地经过长期研究，令人意外地开发出了一种新的GLP肽类似物的缀合物，在相同实验条件下，与现有公认的最好的技术产品代表杜拉鲁肽/索玛鲁肽相比，在普通老鼠及糖尿病老鼠模型上，其体内持续降糖活性时间可提高1倍左右，意味着在人体内可实现至少每周间隔给药、甚至每两周间隔或更长时间间隔的给药频率，并且能同时保证治疗特性，相当于、甚至优于进口昂贵的现有技术。另外，由于分子构建的特点，这种新的GLP-1肽类似物生产体系更为便宜，极大的降低了类似物的生产成本，具有良好的市场开发前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
如下结构式所示的肽缀合物或其药学上可接受的盐，

【技术特征摘要】
1.如下结构式所示的肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，B为其中m是0、1、2或3；n是1、2或3；p是1-8的任意整数；A是含HOOC(CH2)qCO-的酰基，其中q是4-38的整数。2.权利要求1所述的肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，所述B的结构为其中m是1，n是1；A选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-和HOOC(CH2)22CO-，优选为HOOC(CH2)16CO-。3.制备权利要求1或2所述的肽缀合物或其药学上可接受的盐的方法，其包括：(1)提供Val8-Glu22-Arg34-GLP-1类似物溶液，调整pH；(2)向步骤(1)获得的溶液中加入三乙胺；(3)将如下结构的脂肪酸溶于乙腈中；其中m＝1～3，n＝1-3，优选为m＝1，n＝1；(4)将步骤(2)获得的GLP-1类似物溶液与步骤(3)获得的脂肪酸溶液混合，静置；(5)调节pH终止反应，酸沉，离心，得沉淀；(6)向步骤(5)获得的沉淀中加水溶解，并加入氢氧化钠，震荡使沉淀溶解，脱保护，调节pH终止反应；(7)分离纯化。4.权利要求3所述的方法，其包括：(1)提供浓度为4～6mg/ml的Val8-Glu22-Arg34-GLP-1类似物溶液，调整pH至9-12；(2)向步骤(1)获得的溶液中加入0.1-0.5％(V/V)的三乙胺；(3)称...

【专利技术属性】
技术研发人员：许铮，李响，李峰，
申请(专利权)人：北京凯因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11