一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法技术方案

本发明专利技术属于生物医学工程领域，具体涉及一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统（mEND‑ Fe3O4@CMCS）的制备方法，采用水热法制备磁性Fe3O4纳米颗粒，以戊二醛为交联剂，利用乳化交联的方法制备磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS，再通过Sulfo‑SMCC的交联作用将Endoglin适配体修饰在Fe3O4@CMCS表面，得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS，此方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS能有效的靶向小鼠肿瘤新生血管内皮细胞（mTEC）表面CD105分子，实现对荷肝癌移植瘤小鼠的MRI成像能力，具有灵敏度高、T2成像效率好、MRI造影效果好，同时低毒性、驰豫率高、生物相容性好且对肝脾具有靶向性等优点。

Method for preparing specific magnetic Endoglin aptamer imaging probe system

The invention belongs to the field of Biomedical Engineering, in particular to a specific magnetic Endoglin aptamer imaging probe system (mEND Fe3O4@CMCS) preparation method, preparation of magnetic Fe3O4 nanoparticles by hydrothermal method, using glutaraldehyde as crosslinking agent, preparation of magnetic chitosan nanoparticles by emulsion crosslinking method Fe3O4@CMCS, then Endoglin aptamer modified on the surface of Fe3O4@CMCS Sulfo cross-linked by SMCC, Endoglin magnetic aptamer probe imaging mEND Fe3O4@CMCS, magnetic Endoglin prepared by this method aptamer probe mEND imaging Fe3O4@CMCS can target tumor neovascular endothelial cells efficiently (mTEC) surface CD105 molecules, MRI imaging ability of in tumor bearing mice, with high sensitivity and good efficiency of T2 imaging and MRI contrast effect, and low toxicity, high rate of relaxation It has the advantages of good biocompatibility and targeting to the liver and spleen.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法
本专利技术属于生物医学工程领域，具体涉及一种能靶向的特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统（mEND-Fe3O4@CMCS）的制备方法。
技术介绍
Endoglin（CD105）是一种分子量约为68kd的细胞膜糖蛋白，是转化生长因子-β（TGF-β）受体复合物的组成成分之一，能独立存在于细胞表面，是与内皮细胞增殖相关且可被缺氧环境诱导的蛋白。核酸适配体（aptamer）是一类具有高度特异性以及高亲和力的核酸分子，通过指数富集系统（SELEX）从随机的寡核苷酸库中筛选而得到的小分子DNA或RNA，因此它对靶点具有较高的亲和力和特异性，可用于疾病的诊断和靶向治疗。磁性纳米材料具有磁学性能，使它能够对外加的磁信号或外部的磁场做出迅速的磁响应，通过一定的方法控制磁刺激信号，能使其高效地运用在磁性分离纯化、肿瘤药物靶向递送、肿瘤热疗以及核磁共振成像等方面。公开号为CN201410209779.8的专利技术专利，公开了一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法，此方法操作复杂、费时且技术要求高，有副作用。制备由Endoglin适配体修饰的磁性mEND-Fe3O4@CMCS纳米探针，该探针能特异性结合肝癌新生肿瘤血管内皮细胞的方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种平均粒径大小为87.15±1.66nm、成像效率好的特异性磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS的制备方法，利用此探针系统能有效的靶向小鼠肿瘤新生血管内皮细胞（mTEC）表面CD105分子，实现对荷肝癌移植瘤小鼠的MRI成像能力。为了解决这个技术问题，本方法采用如下步骤：a．水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子；b.磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备；c.磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS的制备：将步骤b中的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于HEPES缓冲液中，加入sulfo-SMCC，恒温摇床孵育；磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒，加入2-Endoglin适配体到交联过的磁性粒子中，混匀，恒温摇床孵育，然后加入牛血清蛋白，封闭；用偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次，磁分离，得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS。本专利技术与现有技术相比具有如下优点1)由本方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS能够特异性的与肝癌中表达CD105分子的新生血管内皮细胞结合，阻断Endoglin受体抑制CD105+cells对靶向性纳米材料的内吞作用，具有较好的靶向CD105+cells的能力，灵敏度高，且其靶向作用具有剂量依赖性。2)由本方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS平均粒径大约87.15±1.66nm，表面电位为-31.9±0.5mV，无明显团聚现象，通过GE3.0TMRI成像仪对其进行成像分析，T2成像效率更好，MRI造影效果显著提高，对肿瘤细胞的诊断和治疗有更好的指导作用。3)本专利技术制备工艺简单，易于实现大规模工业化生产，具有粒径小、饱和磁化率高、悬浮分散稳定，同时低毒性、驰豫率高、生物相容性好且对肝脾具有靶向性等优点。4)本专利技术的其他优点和效果将在下面继续说明。附图说明图1：Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS纳米粒子TEM表征图。图2：纳米粒子FTIR结果图（a）CMCS（b）Fe3O4（c）mEND-Fe3O4@CMCS。图3：纳米材料热重分析曲线图。图4：mEND-Fe3O4@CMCS特异性结合表达CD105+的细胞：荧光显微镜观察（A）FITC标记的mEND-Fe3O4@CMCS处理后不同细胞系的荧光图片。（B）FITC标记的RS-Fe3O4@CMCS处理不同细胞系的荧光图片。（C）未标记的Endoglin-Aptamer竞争封闭细胞表面受体后mEND-Fe3O4@CMCS结合CD105+cells的结果。FITC（绿色），DAPI（蓝色）。图5：流式分析仪检测不同纳米材料分别与293T、H22、CD105-cells或CD105+cells细胞的结合能力图。图6：mEND-Fe3O4@CMCS、RS-Fe3O4@CMCS、Fe3O4分别标记CD105+cells后普鲁士蓝染色细胞实验结果图。PBS为对照control组。图7：细胞内铁的吞噬量（A）CD105+cells吞噬不同纳米颗粒的定量分析图（B）CD105+cells吞噬不同浓度mEND-Fe3O4@CMCS纳米颗粒的定量分析图。图8：纳米材料对CD105+cells，CD105-cells，293T和H22细胞的毒性作用（A）Fe3O4（B）mEND-Fe3O4@CMCS。图9：Fe3O4、mEND-Fe3O4@CMCS体外T2-weightedMRI成像结果图。图10：不同纳米材料与CD105+cells孵育后体外MRI成像结果图。图11：Fe3O4、RS-Fe3O4@CMCS和mEND-Fe3O4@CMCS在小鼠体内MRI成像结果图。图12：对小鼠的重要脏器（心、肝脏、肺、脾脏、肾脏）HE染色结果图。具体实施方式本专利技术提供的一种能靶向的特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统（mEND-Fe3O4@CMCS）的制备方法总体思路是：mEND-Fe3O4@CMCS经过了亲水性的壳聚糖包裹和修饰。修饰后的mEND-Fe3O4@CMCS能够特异性的与肝癌中表达CD105分子的新生血管内皮细胞结合，阻断Endoglin受体抑制CD105+cells对靶向性纳米材料的内吞作用，具有较好的靶向CD105+cells的能力，从而提高了材料的成像效率。下面结合具体实例对本专利技术进行进一步描述。实施例1水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子：称取2.502g（0.009mol）七水硫酸亚铁，溶解于30mL的ddH2O中，并加入浓度为50g/L的PEG-2000水溶液10mL，充分搅拌混匀，并逐滴加入30mL稀氨水，继续快速搅拌，并逐滴加入270μLH2O2溶液，至溶液呈现黑色后，继续搅拌20min；将溶液转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应6h后，磁分离洗涤3次，70℃烘干，即得磁性Fe3O4纳米粒子。实施例2磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备：称取羧甲基壳聚糖CMCS0.4g于20mLddH2O中，待搅拌完全溶解后过滤，滤液备用；在滤液中加入0.4g制备好的Fe3O4磁性纳米粒子，超声5min，得到分散均匀的Fe3O4磁性纳米粒子分散液；于250mL的三口瓶里加入58.2mL液体石蜡油，1.8mLspan-80；然后边搅拌边加入中分散均匀的Fe3O4磁性纳米粒子分散液（水相），混合液超声30min，使其分散均匀，充分搅拌反应2h；加入25%的戊二醛溶液2mL，继续搅拌反应1.5h；待反应完全后用石油醚磁分离洗涤3次，再用丙酮磁分离洗涤3次；所得产物于真空干燥箱70℃干燥，研磨得到磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS。实施例3磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS的制备：将磁性壳聚糖纳米颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法，包括如下步骤：a．水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子；b. 磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备；c. 磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS 的制备：将步骤b中的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于HEPES缓冲液中，加入sulfo‑SMCC，恒温摇床孵育；磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒，加入2‑Endoglin适配体到交联过的磁性粒子中，混匀，恒温摇床孵育，然后加入牛血清蛋白，封闭；用偶联缓冲液洗涤纳米粒子2‑3次，磁分离，得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS。

【技术特征摘要】
1.一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法，包括如下步骤：a．水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子；b.磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备；c.磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS的制备：将步骤b中的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于HEPES缓冲液中，加入sulfo-SMCC，恒温摇床孵育；磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒，加入2-Endoglin适配体到交联过的磁性粒子中，混匀，恒温摇床孵育，然后加入牛血清蛋白，封闭；用偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次，磁分离，得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS。2.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法，其特征在于步骤a水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子的步骤是：将FeSO4·7H2O水溶液和PEG-20000水溶液混合，不断搅拌下滴加稀氨水调节溶液pH值为10.0，溶液呈墨绿色；30℃持续搅拌下逐滴加入H2O2溶液，此时溶液呈黑色；将溶液转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应6h；磁分离收集下层沉淀，先后用纯水和无水乙醇磁分离洗涤，然后将其置于70℃下烘干；烘干后研磨即得磁性Fe3O4纳米粒子。3.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法，其特征在于步骤b磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备步骤是：将羧甲基壳聚糖CMCS溶于ddH2O中，待搅拌完全溶解后过滤，滤液备用；在滤液中加入步骤a制备好的Fe3O4磁性纳米粒子，超声分散均匀；在250mL的三口瓶里加入60mL液体石蜡油，边搅拌边加入Fe3O4磁性纳米粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，周素芳，黄盈盈，黄勇，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45