测定微生物的改进的方法技术

本发明专利技术涉及纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料中微生物含量的测定。酶法预处理包含纤维素的材料和使用基于PCR的技术测定微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测定微生物的改进的方法
本专利技术涉及测定纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料中微生物含量的方法。
技术介绍
纸和板(board)是在许多工业领域中使用的重要包装材料。包装纸或板可向包入(enclosed)的物体提供物理或化学保护；它们还可以例如提供信息和强化营销和物体的份量控制(portioncontrol)。纸和板在食品工业中包括包装的众多应用中具有较长的历史。作为包装材料，纸经常与食物直接接触。纸和板的容器用于干燥的食物、液体和冷冻产品。纸包装材料(paperwrapping)常用于快餐和糖果、药品包装、香烟包装、奢侈品包装和高档图形产品。包装保护内容物(content)免受环境的有害因素的作用因此延长了被包装的内容物的有效寿命。对于消费者包装板产品的卫生要求是极其高的。纸和板一般主要由纤维素纤维、碳酸钙、淀粉和半纤维素构成。所有这些都是天然组分且可充当造成污染的微生物的生长介质。具有高营养物和淀粉含量的水的循环是微生物感染的常见源头。传统上，已经通过使用微生物学的方法评估物质的微生物纯度，所述方法需要培养(cultivation)待分析的表面或材料的样品。组成和培养条件(温度、时间、介质)对方法的准确性有影响。用于定量分析的样品必须被稀释到这样的程度，可以对由细胞形成的单个菌落(colony)计数(count)。在被研究样品中可存在几十个(dozens)或至多几百个细胞。在平行样品中的菌落计数可变化很大并且，因此，再现性是差的。因此，准确性和可靠性是差的。此外，微生物方法典型地是劳动密集型(laborintensive)且耗费时间的并且因此对于纸和纸板的纯度的跟踪(followup)(监控)不是最优的(optimal)。在包括纸张的造纸方法中识别微生物的基于聚合酶链反应(PCR)的方法是已知的，例如US8613837和US2013189152。由于现在的方法是劳动密集型的、耗费时间的且它们的准确性和灵敏度都不令人满意，需要测定纸和板材料的微生物纯度的改进的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供测定纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料中的造成污染的微生物的改进的方法。该目的通过将要被描述的本专利技术和权利要求而实现。本专利技术的第一目的是测定纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料中的微生物含量的方法。所述方法的特性特征在权利要求1的特征部分给出。本专利技术的第二目标是在使用定量PCR测定微生物之前，纤维素酶在纸浆和造纸工业中预处理包含纤维素的材料的用途。所述方法允许对纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料以及所得纸和板材料(例如消费者(consumer)包装材料、特别是食物包装材料)的微生物纯度的简单且准确的跟踪。由此因为可以在较早阶段探测到可能的污染物，包装材料的卫生得到了强化。附图说明图1示出用于悬浮在缓冲溶液中并且经历挤压过滤(compressionfiltration)的经接种(inoculated)的板中的细菌的qPCR分析与用于测定微生物的传统培养的对比。图2示出用于悬浮在缓冲溶液中并且经历袋离心过滤的经接种的板中的细菌的qPCR分析与用于测定微生物的传统培养的对比。图3a和3b示出在两个不同的纸或板中测定微生物的根据本专利技术的方法和基于传统培养的方法的对比。图4示出如下的用于在板中测定微生物的方法对比：第一使用qPCR而没有酶法预处理；第二根据根据本专利技术；和第三使用基于传统的培养的方法。图5示出使用如下的微生物测定的对比：传统培养；没有酶法预处理的qPCR；挤压过滤作为预处理；过滤袋离心作为预处理；和使用两种不同的混合的市购纤维素酶制剂(cellulasepreparation)的根据本专利技术的方法。具体实施方式专利技术人令人惊奇的发现基于PCR的纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料的微生物纯度的测定可以通过样品的酶法预处理(enzymaticpretreatment)而得到显著的强化。而且当造成污染的微生物的水平非常低时，酶法预处理允许使用PCR定量检测。根据专利技术，纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料中的微生物含量的测定包括如下步骤：(a)提供包含纤维素的材料的样品的悬浮液(suspension)；和(b)用一种或多种具有纤维素酶活性的酶制剂处理步骤(a)的悬浮液；和(c)从步骤(b)的经酶处理的悬浮液中分离微生物；和(d)从步骤(c)的经分离的微生物中分离核酸；和(e)对步骤(d)的经分离的核酸进行PCR分析，其中PCR结果指示(indicate)样品的微生物含量。如本领域已知的，阳性PCR结果指示存在某种核酸且因此存在某种微生物，而qPCR用来测定微生物水平。在这方面，应将“微生物含量”理解为涵盖定性(例如识别微生物品系(strain))和定量(例如形成细菌单元的菌落的量)的样品的微生物含量这两者。在样品材料中测定定量和定性的微生物含量可独立地或一起完成。定性含量可以使用对于某些属(genera)或种(species)的特定的引物(primer)进行测量。PCR产物的存在表明存在微生物且可以使用凝胶电泳或优选使用qPCR设备分析测定。必要时，定量测定使用qPCR设备和已知的对照(control)实施。可使用宽范围(broadrange)的引物或特定引物。根据本专利技术，术语“纸浆和造纸工业中包含纤维素的材料”是指纸浆中和造纸工业中含有纤维素的材料，包括原材料、生产工艺期间的纤维素材料和最终产品。包括纤维素(纤维素材料)的该材料的实例为，不限于，木屑、机械浆和各种纸和板。纸浆，各种纸和板都是优选材料。消费者板是特别优选的且食物和液体的包装板是最优选的包括纤维素的材料。在这方面，术语“消费者板”包括一般包装板、食物和非食物包装板、液体包装板、药品包装板、香烟板和图形版(graphicalboard)。待测试微生物纯度的纸或板可以是单层或多层以及是经涂覆的或未涂覆的。纸或板包含纤维素纤维和任选地可变量的半纤维素和任选地其他组分和/或涂层(coating)。半纤维素含量或涂层可对酶制剂的最优组成有影响。优选的纸和板的材料是消费者包装板、特别是液体和食物材料的包装板。可直接从制造工艺的含水相(aqueousphase)提取悬浮液。然而，当悬浮液来自工艺或含水产物时，必须确保溶液适合后续步骤中的酶制剂的活性。如果必要，必须改变缓冲溶液。可将潜在地受到污染的包含纤维素的材料的样品悬浮在溶液(典型地为适合待使用的酶制剂的活性的缓冲溶液)。在悬浮步骤前可将纸或板材料拼接(splice)，例如使用剪刀。通常通过机械研磨和/或例如涡流强化纸或板的材料的悬浮步骤。可在StandardMethodsfortheExaminationofDairyProducts，17thedition，APHApublications中找到悬浮样品的优选的方法的一个实例。来自制浆(pulping)工艺的样品可在没有机械研磨的情况下经历酶处理。然而。在一些情况中，悬浮液缓冲溶液必须改变以便满足后续步骤中酶活性的要求。然后，使测定重量的(优选均质化的)悬浮液与含有一种或多种纤维素酶且优选半纤维素酶活性的酶制剂接触。典型地向悬浮液添加酶制剂。用纤维素降解酶(cellulolyticenzyme)处理悬浮液以便强化微生物和纤维质(fibrous)材料的分离。根据本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定纸浆和造纸工业中的包含纤维素的材料中的微生物含量的方法，包括步骤：(a)提供包含纤维素的材料的样品的悬浮液；和(b)用一种或多种具有纤维素酶活性的酶制剂处理所述悬浮液；和(c)从经酶处理的悬浮液分离微生物；和(d)从分离出的微生物分离核酸；和(e)对分离出的核酸进行PCR分析，其中PCR结果指示微生物含量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.测定纸浆和造纸工业中的包含纤维素的材料中的微生物含量的方法，包括步骤：(a)提供包含纤维素的材料的样品的悬浮液；和(b)用一种或多种具有纤维素酶活性的酶制剂处理所述悬浮液；和(c)从经酶处理的悬浮液分离微生物；和(d)从分离出的微生物分离核酸；和(e)对分离出的核酸进行PCR分析，其中PCR结果指示微生物含量。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过将样品悬浮在溶液中提供悬浮液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中纤维素酶活性是纤维素酶活性的混合。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中纤维素酶活性为至少一种内切葡聚糖酶活性。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中酶制剂进一步包含一种或多种半纤维素酶活性。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中使用过滤袋离心将微生物从悬浮液分离。7.根据前述权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：K帕蒂佩利宁，J拉萨宁，K海尔梅莱，A凯图宁，KJ里海宁，
申请(专利权)人：斯道拉恩索公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI