一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法技术

一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法，属电致化学发光生物传感器及其制备技术领域。该修饰电极仅由未经标记的三磷酸腺苷ATP适配体和氮掺杂碳量子点NCQDs构成；制备过程包括将NCQDs悬浊液和ATP适配体溶液依次滴涂到玻碳基础电极上即可，没有使用成膜剂；该修饰电极具有组成结构及制备过程简单、无标记等优势，可用于快速灵敏地检测ATP，并具有检测限低、线性范围宽等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法
本专利技术属于生物传感器
，特别涉及一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法。
技术介绍
三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate,ATP)是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“能量通货”，它在细胞代谢和细胞生理生化途径中起重要作用。ATP的浓度和及其消耗率是许多疾病的指示剂，例如缺氧、低血糖和帕金森氏病等。因此，ATP的快速高效测定，在生物化学研究与临床医学诊断中都有非常重要的意义。近年来，适配体(aptamer)作为识别元件能高效、特异性地结合目标生物小分子，为化学生物学和生物医学提供了一种新的研究平台。由于其自身稳定性好、制备合成相对简单、易获得、易功能化修饰与标记等优势，在生物传感器设计中成为研究热点。在文献(1)中国专利技术专利公开号CN101936945A中，徐国宝等人设计了一种检测ATP的传感器，其修饰电极的设计原理如下：将ATP适配体链分成两个序列，分别为DNA单链和部分DNA双链中第一链3’末端，提供部分DNA双链中第二链，其与所述部分DNA双链中第一链5’末端互补，从而可形成部分DNA双链。将表面固定有DNA单链的金电极浸入所述部分DNA双链与待测样品的混合液中后，以钌化合物作为电化学发光探针对所述金电极进行电致化学发光(ECL)检测。由于钌化合物配体较大的芳香环具有嵌入DNA双链结构的功能，因此，在不存在ATP的情况下，所述DNA单链与所述部分DNA双链相互间不结合，因此很少有钌化合物到达电极表面，从而不产生或产生微弱的ECL信号；当有ATP存在时，在ATP诱导下DNA单链和部分DNA双链及ATP结合，在电极表面形成复合物。作为ECL探针，钌化合物通过嵌入DNA双链结构到达电极表面，产生较强的ECL信号，实现对ATP的检测。但该工作采用将探针分子钌化合物嵌入到DNA双链结构与单链DNA共同作用实现对ATP的检测，会导致适配体与ATP结合力下降的问题，并且电极制备及测试操作过程较复杂。在文献(2)AnalyticalChemistry,2014,86:8735-8741中，YuetingLiu等人设计了一种“三明治”结构的传感器来检测ATP，其修饰电极的设计原理如下：“三明治”结构是通过两个杂交反应来实现，首先玻碳电极表面固定上量子点的DNA1与ATP适配体杂交，然后修饰有DNA2的信号探针与适配体杂交，从而形成三明治结构。当目标检测物ATP不存在时，信号探针可以消耗溶解氧导致共反应试剂的消耗，使得ECL强度降低，当目标检测物ATP存在时，ATP与适配体结合，导致适配体脱离电极表面，因此信号探针在电极表面有较低的负载量，实现了目标分析物诱导的结构转换，引起ECL强度的增加，从而实现ATP的检测。该工作采用信号探针标记的方法设计了一种“三明治”结构来检测ATP，但该方法利用两次杂交使适配体与其互补链互补，导致适配体与ATP结合力下降，同时采用标记物标记，测试操作过程较复杂。在文献(3)BiosensorsandBioelectronics,2013,47:271-277中，JuanjuanLu等人利用ATP适配体设计了一种检测ATP的传感器，其修饰电极的设计原理如下：将ATP适配体分成两段分别为DNA1与DNA2（DNA2的3’末端修饰上二氧化硅与石墨烯量子点GQDs的复合物），首先DNA1通过金硫键固定于金电极表面，将电极用巯基乙醇行封闭，再将电极浸入含有DNA2与ATP的溶液中，在ATP存在的情况下，DNA1、DNA2和ATP结合在一起，因此GQDs固定于电极表面，引起ECL强度的增加，ATP浓度越高，电极表面石墨烯量子点负载量越多，因此ECL强度越高，据此实现对ATP的检测。该方法中GQDs具有低毒性和较好生物相容性，但该方法需要对ATP适配体链末端进行修饰，以将量子点修饰到适配体链上产生信号，此操作引起适配体与ATP结合力降低的问题，且测试操作过程较复杂。
技术实现思路
在已报道的基于ATP适配体检测ATP的文献中，修饰电极测试原理及修饰电极制备过程均较复杂，亟需设计制备测试原理简单、制备过程简便、无标记且成本低廉的修饰电极。因此本专利技术提出了一种基于ATP适配体检测ATP的修饰电极的新设计原理，如图1所示。修饰上氮掺杂碳量子点NCQDs的玻碳电极在含有共反应试剂K2S2O8的磷酸缓冲液PBS中，有较强的ECL响应，当在电极表面继续修饰ATP适配体后，由于适配体与NCQDs间的π-π作用及分子间相互作用，适配体平铺在电极表面，使得NCQDs与K2S2O8接触大幅降低，从而引起ECL强度下降，当ATP存在时，由于适配体与ATP特异性结合，导致适配体卷曲或者脱离电极表面，使得NCQDs暴露在电极表面，从而与K2S2O8接触，引起ECL强度增加，因此，在一定范围内，随着ATP浓度的增加，ECL强度不断增加。本专利技术的目的在于提供一种利用上述设计原理且基于碳点检测ATP的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有NCQDs和ATP适配体；其中，NCQDs负载量为8.6×10-4~4.3×10-2g/cm2，ATP适配体负载量为4.3×10-4~8.6×10-1g/cm2。该修饰电极仅由未经标记的ATP适配体和NCQDs碳点构成，甚至没有使用到成膜剂，具有组成结构简单、无标记等优势。本专利技术的另一目的在于提供一种制备上述基于碳点检测ATP的修饰电极的方法，其特征在于，包括如下步骤。(1)NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于去离子水中，配制成质量浓度为0.1~0.3g/mL的浊液；将浊液置于190~230℃的烘箱中反应8~10h，至浊液变成黄色固体；按照黄色固体与去离子水的固液比为0.01~0.10g/mL的比例将黄色固体分散于去离子水中，以8000×g~10000×g的离心力离心，取上清液于30kDa~40kDa的高截留分子量超滤管中以4000×g~6000×g的离心力离心，将下层滤液用3kDa~4kDa的低截留分子量超滤管以4000×g~6000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所获得的上层滤液中继续加入去离子水以4000×g~6000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤6~10次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.01~0.5mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4℃冰箱中备用。(2)ATP适配体溶液的配制：将ATP适配体用去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为0.5~9mg/mL的ATP适配体溶液。(3)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0μm、0.3μm、0.03μm的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1mol/LKCl的1.0mmol/LK3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80mV以下，电极方可使用。(4)修饰电极的制备：用10μL移液枪取6μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于碳点检测三磷酸腺苷ATP的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有氮掺杂碳量子点NCQDs和ATP适配体；其中，NCQDs负载量为8.6×10

【技术特征摘要】
1.一种基于碳点检测三磷酸腺苷ATP的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有氮掺杂碳量子点NCQDs和ATP适配体；其中，NCQDs负载量为8.6×10-4~4.3×10-2g/cm2，ATP适配体负载量为4.3×10-4~8.6×10-1g/cm2。2.一种制备权利要求1所述基于碳点检测ATP的修饰电极的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于去离子水中，配制成质量浓度为0.1~0.3g/mL的浊液；将浊液置于190~230℃的烘箱中反应8~10小时，至浊液变成黄色固体；按照黄色固体与去离子水的固液比为0.01~0.10g/mL的比例将黄色固体分散于去离子水中，以8000×g~10000×g的离心力离心，取上清液于30kDa~40kDa的高截留分子量超滤管中以4000×g~6000×g的离心力离心，将下层滤液用3kDa~4kDa的低截留分子量超滤管以4000×g~6000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所获得的上层滤液中继续加入去离子水以4000×g~6000×g的离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文胜，郭学飞，刘长霞，陈旭，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11