检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列Probe GN为：5'‑CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG‑3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。本发明专利技术的分子信标探针能够泌尿生殖道病原体淋球菌，且检测准确度高，灵敏度高。

Molecular beacon probe and kit for detecting urogenital tract pathogens Neisseria gonorrhoeae

The invention discloses a method of detecting the molecular beacon probe of gonococcal urogenital tract pathogens, the nucleotide sequence of Probe GN the molecular beacon probe: 5'CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG 3', the molecular beacon probe 5'end labeled with a fluorophore and quencher labeled with 3'. The molecular beacon probe of the present invention has the advantages of high detection accuracy and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒
本专利技术涉及一种分子信标探针，具体涉及一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒。
技术介绍
引起泌尿生殖道炎症最常见的病原体包括淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体。目前对淋球菌的诊断主要有直接镜检和细胞培养。直接镜检虽然速度快但准确率较低，常用的细胞培养法准确性虽然有所提高但时间消耗久，且检测过程较复杂。因此提供一种准确、简单且灵敏度较高的泌尿生殖道病原体淋球菌检测方法有着显著的临床意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：ProbeGN：5'-CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG-3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。优选的，所述荧光基团选自FAM、Fluorescein、JOE、TET、HEX、Cyanine3、ROX、TexasRed、Cyanine5或Cyanine5.5，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-2或DABCYL。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包括上述分子信标探针。优选的，上述试剂盒还包括杂交液，每100ml所述杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。优选的，使用上述所述分子信标探针的浓度为5pmol/ul。本专利技术还提供了对泌尿生殖道病原体淋球菌进行检测的方法，该方法包括以下步骤：(1)按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16SRNA基因序列设计荧光信标探针，其中淋球菌(n.gonorrhoeae)16SRNA基因序列为：TTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGGGATACCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGAGCCCGCTTACCACGGTATGCTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAGAGAGAGAAGGGCTTTAGGCATTCACACTTATCGGTAAACTGAAAAGATGCGGA所设计合成的分子信标探针ProbeGN的碱基序列为：5'-CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG-3'，其5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团；(2)以泌尿生殖系统分泌物为检测样本，涂片并用固定液固定；(3)用上述杂交液将所述分子信标探针进行稀释，然后与检测样本进行杂交；(4)在荧光显微镜下观察结果。本专利技术检测的原理为：具有独特“发夹”空间结构的分子信标探针在未与靶序列结合时，分子信标呈“发夹”结构，有一环序列和一茎序列，其中环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测到该荧光信号。本专利技术的分子信标探针能够泌尿生殖道病原体淋球菌，且检测准确度高，灵敏度高。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16SRNA基因序列设计分子信标探针，该分子信标探针碱基序列为：5'FAM-CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG-BHQ13'。其中5'端标记的是FAM，3'端标记的是BHQ1，荧光基团的激发波长为494nm，发射波长为515nm。按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16SRNA基因序列设计荧光标记寡核苷酸探针ProbeGNc：5'-FAM-CATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAA-3'。实施例1以培养的淋球菌(n.gonorrhoeae)作为检测目标。收集2例女性泌尿生殖系统分泌物为标本，按照比例加入培养的淋球菌，比例分别为A.单纯淋球菌、B.单纯的女性泌尿生殖系标本、C.按10000细菌/ml的比例加入淋球菌。将以上A、B、C三例样本分别以1xPBS稀释，5000rpm离心，收集沉淀物，加入10％福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)250ul固定液固定5分钟，以1xPBS500ul洗2次，最后3000rpm离心5分，弃掉上清，将经热变性的分子信标探针以1xDNA杂交液稀释到5pmol/ul，加200ul使沉淀悬浮，42℃孵育15分钟。滴加在载玻片，直接在荧光显微镜下观察并照相，计算荧光显色细菌。结果不加淋球菌的样本无荧光染色即阴性，单纯的淋球菌样本全部细菌都有荧光染色即阳性，按10000细菌/ml的比例加入淋球菌的样本，可以观察到部分细菌有荧光染色亦即阳性。每100ml上述DNA杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。实施例2利用分子信标探针ProbeGN进行检测：以已知的50例淋球菌感染者、50例健康人的尿道分泌物样本作为检测目标。将样本轻缓涂抹在洁净载玻片上，充分晾干后，使用丙酮固定10分钟，自然晾干。将经热变性的分子信标探针以1xDNA杂交液稀释到5pmol/ul，加200ul使沉淀悬浮，42℃孵育15分钟。滴加在载玻片，直接在荧光显微镜下进行阅片。利用上述普通型荧光标记寡核苷酸探针ProbeGNc进行检测：以已知的50例淋球菌感染者、50例健康人的尿道分泌物样本作为检测目标。将样本轻缓涂抹在洁净载玻片上，充分晾干后，使用丙酮固定10分钟，自然晾干。接着加入75℃变性5分钟5pmol/ul的荧光标记寡核苷酸探针ProbeGNc探针(探针以杂交缓冲液(20mmol/LTris,0.9mmol/LNaCl，20％formamide，0.1％SDS,pH7.2)稀释)，然后在50℃下孵育45～60分钟；将玻片依次用洗液A(2xSSC、50％甲酰胺)、洗液B(10mMPBSpH8.0、0.1％NonidetP-40)各清洗2次。在荧光显微镜下进行阅片。分子信标和普通荧光标记寡核苷酸探针实验结果的判断标准相同均为：在60倍油浸物镜下对标本进行多视野观察并对每视野中发出荧光的细胞进行计数并累加，按如下判断标准：标本阴性(-)：连续观察100个不同视野，未发现有发出荧光的细胞；标本阳性(+)：连续观察100个不同视野，发出荧光的细胞数大于1个/100视野，进行实验结果判定。按上述判定标准进行判断，实验结果如下表：已知标本(金标准)分子信标探针荧光寡核苷酸探针样品数+++46++-4---47--+3注：上述列表中，已知标本(金标准)：已知50例健康人尿道分泌物样本作为阴性金标准，已知50例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：Probe GN：5'‑CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG‑3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：ProbeGN：5'-CCCTACCCCATAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGGTAGGG-3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的一种检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、Fluorescein、JOE、TET、HEX、Cyanine3、ROX、TexasRed、Cyanine...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙喜元，王季武，
申请(专利权)人：苏州承美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32