革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法技术

一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜5‑10次，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；获得的菌悬液通过化学试剂处理后进行直接MALDI‑TOF质谱鉴定，有效避免了现有技术中整个过程耗时长的缺陷。

Gram positive bacteria positive blood culture separation gel and pretreatment method of chemical reagent

A gram positive bacteria positive blood culture separation gel and chemical reagent pretreatment methods, 3.5ml blood culture positive solution to 3.5ml separation hose; the hose is placed into a centrifuge separation effect, centrifuge centrifugal force in the 4000g under the centrifugal 10min in biofilm; don't touch the rubber hose separation conditions the positive blood culture supernatant liquid suction; 1ml sterile double distilled water repeatedly blowing and suction surface of membrane separation gel 5 10 times, in order to make the biofilm bacteria suspension in sterile suspension form double distilled water; the bacterial suspension for direct identification of MALDI TOF mass spectrometry through chemical treatment, effectively avoid the whole process of long time-consuming defect in the prior art.

【技术实现步骤摘要】
革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法
本专利技术涉及革兰氏阳性菌阳性血培养
，具体涉及一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法。
技术介绍
现有的革兰氏阳性菌阳性血培养的鉴定方法是：血培养仪阳性报警后按传统流程处理，涂片革兰染色、显微镜观察、转种血或巧克力平板在厌氧或需氧条件下培养24-48h获得纯菌落后，再使用现有的基于生化反应或免疫学方法的商品化仪器如Vitek2Compact和BDPhoenixTM-100等进行鉴定。但是目前这样的方法需要将阳性血培养液转种至培养基上，培养孵育至肉眼可见的单个纯菌落后，再挑选单个纯菌落通过后续的方法进行鉴定，整个过程耗时较长(约24h-48h)。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，有效避免了现有技术中整个过程耗时长的缺陷。为了克服现有技术中的不足，本专利技术提供了一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法的解决方案，具体如下：一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜5-10次，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5mlEP管中，将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤6：再次往EP管中加入1ml无菌双蒸水后进行反复吹吸洗涤，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤7：往EP管中加入1ml无菌双蒸水及200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；步骤8：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤9：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；步骤10：接着在室温条件下把该EP管静置10min；步骤11：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤12：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；步骤13：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置5-10min；步骤14：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；步骤15：取1μlEP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。如果在执行所述步骤9的过程中不能将菌体沉淀物吹吸混匀(如菌体沉淀过分粘稠，菌体过大不易混匀)，则进行如下步骤：步骤1-1：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清步骤1-2：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇500μl构成第四混合物，然后对该第四混合物进行吹吸混匀，之后将吹吸混匀后的第四混合物转移入预先加有100-200μl无菌且直径为0.5mm的玻璃珠的圆底EP管中，把EP管放置在涡旋振荡仪上在涡旋振荡仪的最大转速的条件下进行涡旋震荡10min；步骤1-3：把EP管在室温的条件下静置10min后，将EP管中的菌液转移至新的EP管中，然后转入所述步骤11中执行。本专利技术的有益效果为：本专利技术的革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶及化学试剂前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时约30-40min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。附图说明图1是本专利技术的嵌接设备的结构示意图；图2是本专利技术的第一嵌接部的结构示意图；图3是本专利技术的第二嵌接部的部分截面示意图；图4是本专利技术的嵌接设备的剖视图。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本专利技术做进一步地说明。实施例1革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜5次，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5mlEP管中，将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤6：再次往EP管中加入1ml无菌双蒸水后进行反复吹吸洗涤，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤7：往EP管中加入1ml无菌双蒸水及200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；步骤8：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤9：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；步骤10：接着在室温条件下把该EP管静置10min；步骤11：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤12：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；步骤13：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置5min；步骤14：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；步骤15：取1μlEP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜5‑10次，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤6：再次往EP管中加入1ml无菌双蒸水后进行反复吹吸洗涤，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤7：往EP管中加入1ml无菌双蒸水及200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；步骤8：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤9：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；步骤10：接着在室温条件下把该EP管静置10min；步骤11：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤12：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；步骤13：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置5‑10min；步骤14：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；步骤15：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα‑氰基‑4‑羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。...

【技术特征摘要】
1.一种革兰氏阳性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜5-10次，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5mlEP管中，将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤6：再次往EP管中加入1ml无菌双蒸水后进行反复吹吸洗涤，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤7：往EP管中加入1ml无菌双蒸水及200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；步骤8：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤9：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；步骤10：接着在室温条件下把该EP管静置10min；步骤11：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；步骤12：继续让离心机在13000rpm的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨启文，周梦兰，徐英春，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11