一种固液结合制备地加瑞克的方法技术

本发明专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种采用固液结合的化学方法制备地加瑞克的方法，本发明专利技术首次合成片段肽Ac‑D‑2Nal‑D‑4Cpa‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(Fmoc)‑OH用于地加瑞克的固相合成，合成过程简单，所用原料便宜易得，易于放大生产；本发明专利技术避免使用剧毒试剂HF，采用TFA组合裂解后，经纯化、冻干得到纯度99.5％的精肽，且总收率达到65％。

A combination of solid and liquid preparation method of degarelix

The invention relates to the field of peptide synthesis, particularly relates to a method for chemical methods combined solid preparation of degarelix, the first synthetic peptide Ac D 2Nal D 4Cpa D 3Pal Ser (tBu) 4Aph (Fmoc) OH for solid phase synthesis of degarelix, synthesis process simple, the raw material is cheap and easy to get, easy to enlarge the production; the invention avoids the use of toxic reagents HF, using TFA combination after pyrolysis, purified and freeze-dried sperm peptide purity of 99.5%, and the total yield reached 65%.

【技术实现步骤摘要】
一种固液结合制备地加瑞克的方法
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备地加瑞克的方法。技术背景地加瑞克(Degarelix)由FerringPharmaceuticals开发，于2008年12月24日在美国上市，商品名Firmagon,用于治疗晚期前列腺癌；地加瑞克是一种促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物，可逆性抑制垂体GnRH受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放，其通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化；其可以避免以激素治疗前列腺癌来降低睾酮浓度的初期却造成睾酮浓度激增的弊端，由此可以避免初始刺激该激素受体可暂时性促进肿瘤生长而不是抑制它，临床研究显示，其疗效显著，临床应用前景广阔。地加瑞克为含有七个非天然氨基酸的线性十肽，分子量为1630.75，其氨基酸序列为Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2，其中Ac为乙酰基(acetyl)，2Nal为2-萘基丙氨酸(2-naphthylalanine)，4Cpa为4-氯苯丙氨酸(4-chlorophenylalanine)，3PaI为3-吡啶基丙氨酸(3-pyridylalanine)，4Aph为4-氨基苯丙氨酸(4-aminophenylalanine)，Hor为氢化乳清酸，Cbm为氨基甲酰(carbamoyl)，Lys(iPr)为N6-异丙基赖氨酸(N6-isopropyllysine)；其结构式如下：国内外报道了Boc和Fmoc两种化学合成地加瑞克的方法，在Boc方法中，专利US5925730中公开了采用Boc化学固相合成方法，首先制备得到地加瑞克；其中6位4Aph(Cbm)采用Boc-4Aph(Fmoc)-OH为合成原料接入肽序中，偶联后，脱掉Fmoc,用叔丁基异氰酸酯与侧链氨基反应，得到酰胺被叔丁基保护4Aph(Cbm)，叔丁基在随后的TFA脱Boc过程中一起被脱掉；其中5位4Aph(Hor)也是采用Boc-4Aph(Fmoc)-OH为合成原料接入肽序中，脱掉Fmoc后,与L-氢化乳清酸发生偶联反应，得到4Aph(L-Hor)；专利US5977302中公开了采用Boc化学液相合成方法，经由“4-2-4”、“3-3-4”或“3-4-3”液相合成策略完成地加瑞克的合成；以上合成方法需要用到剧毒HF作为裂解试剂，所以大批量生产受到限制；而专利US9090656同样也采用Boc化学法液相片段策略“3-4-3”制得地加瑞克，其采用了不同于专利US5925730和US5977302的侧链保护策略，有效的避免了HF的使用，但是合成过程中多次使用到钯碳脱保护基，不仅操作繁琐，成本较高，而且容易造成重金属超标等不利因素。在地加瑞克结构中自N端起第五位为非天然氨基酸4Aph(L-Hor)，其结构为(L-氢化乳清酸)-4-氨基-苯丙氨酸，在碱性条件下，结构中二氢尿嘧啶会发生重排而成为乙内酰脲(Koedjikov,A.H.et.al.,J.Chem.Soc.Perkin,Trans.2,1984,pages1077-1081；Kaneti,J.et.al.,Org.Biomol.Chem.,2004,pages1098-1103)，重排示意如下：在碱性条件下，由结构式Ⅰ重排为结构式Ⅱ。Fmoc化学固相合成策略操作简单，避免了使用剧毒HF做裂解试剂，在多肽合成中被广泛应用；但是由于Fmoc化学中，不可避免的重复使用碱性条件脱氨基保护基Fmoc,所以采用Fmoc化学固相合成地加瑞克的试验方案设计尤为重要。为避免重排的发生，US8828938采用Fmoc化学固相合成地加瑞克，并对重排进行了试验，指出在用20％哌啶/DMF脱保护处理多个循环后，均未发现重排副产物；自N端起第六位为非天然氨基酸4Aph(Cbm)，其采用4Aph(t-Bu-Cbm)保护形势，用TFA裂解并脱保护时间为25h,时间太长，容易引起肽链的降解；WO2012055903用Fmoc化学液相片段法合成地加瑞克，采用“3-7”或“4-6”；专利CN102329373在采用Fmoc化学固相合成地加瑞克时，先引入4Aph(Trt)或4Aph(Alloc),待肽链合成完毕后，脱掉Trt或Alloc，然后和L-氢化乳清酸发生偶联反应；专利CN201310531473用Fmoc化学固相合成地加瑞克时，选择了一条分布、正交、特异性强的保护基策略：自N端起第五位引入4Aph(Teoc)，第六位引入4Aph(Dde),待肽链合成完毕后，先用水合肼的DMF溶液脱掉Dde,与三甲基硅基异氰酸酯发生偶联反应上Cbm；然后再用四丁基氟化铵的DMF溶液脱去Teoc，再与L-氢化乳清酸发生偶联反应；专利CN103351428用Fmoc化学固相合成地加瑞克时，则先引入4Aph(Mmt)或4Aph(Dmt),待肽链合成完毕后，脱掉Mmt或Dmt，然后和L-氢化乳清酸发生偶联反应；专利CN103992392则自N端起第五位引入4Aph(ivDde),脱掉ivDde,然后和L-氢化乳清酸发生偶联反应；上述方案中所采用4Aph保护策略中所需要原料不易获得，并且后处理比较繁琐，生产成本较高。综上所述，Boc化学固相策略要用到剧毒的HF，大批量生产受到限制，液相合成，操作复杂，对操作人员要求较高，同样制约产业化放大；Fmoc化学中，需要重复使用碱性条件脱氨基保护基Fmoc,造成重排杂质的产生，另外Fmoc化学固相合成所采用的策略均存在后处理麻烦，所用保护氨基酸原料不易得，造价昂贵的问题；为此，本专利技术人对地加瑞克的合成方法进行了研究，从而得到本专利技术的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种地加瑞克的合成方法。本专利技术采用固液结合的策略，采用普通的侧链保护基，降低了合成成本，提高了粗肽纯度，从而降低了纯化难度，提高了收率，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种固液结合制备地加瑞克的方法，包括如下步骤：(a)液相条件下制备得到片段肽Ⅰ:Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(Fmoc)-OH；(b)以氨基树脂为固相载体，制备得到片段肽树脂Ⅱ：H-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-NH-Resins；(c)片段肽Ⅰ和片段肽树脂Ⅱ发生偶联，得到肽树脂Ⅲ：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(Fmoc)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala–NH-Resins；(d)肽树脂Ⅲ经脱保护试剂处理后脱掉侧链保护基Fmoc，然后和L-氢化乳清酸发生偶联反应，得到肽树脂IV：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-NH-Resins；(e)肽树脂IV经裂解、纯化、冻干得到地加瑞克精肽。其中以上技术方案步骤(a)中片段肽Ⅰ的合成方法为：将H-4Aph(Fmoc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固液结合制备地加瑞克的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)制备片段肽Ⅰ:Ac‑D‑2Nal‑D‑4Cpa‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(Fmoc)‑OH；(b)以氨基树脂为固相载体，制备得到片段肽树脂Ⅱ：H‑D‑4Aph(Cbm)‑Leu‑Lys(Boc,iPr)‑Pro‑D‑Ala‑NH‑Resins；(c)片段肽Ⅰ和片段肽树脂Ⅱ发生偶联，得到肽树脂Ⅲ：Ac‑D‑2Nal‑D‑4Cpa‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(Fmoc)‑D‑4Aph(Cbm)‑Leu‑Lys(Boc,iPr)‑Pro‑D‑Ala–NH‑Resins；(d)肽树脂Ⅲ经脱保护试剂处理后脱掉侧链保护基Fmoc，然后和L‑氢化乳清酸发生偶联反应，得到肽树脂IV：Ac‑D‑2Nal‑D‑4Cpa‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(L‑Hor)‑D‑4Aph(Cbm)‑Leu‑Lys(Boc,iPr)‑Pro‑D‑Ala‑NH‑Resins；(e)肽树脂IV经裂解、纯化、冻干得到地加瑞克精肽。

【技术特征摘要】
1.一种固液结合制备地加瑞克的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)制备片段肽Ⅰ:Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(Fmoc)-OH；(b)以氨基树脂为固相载体，制备得到片段肽树脂Ⅱ：H-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-NH-Resins；(c)片段肽Ⅰ和片段肽树脂Ⅱ发生偶联，得到肽树脂Ⅲ：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(Fmoc)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala–NH-Resins；(d)肽树脂Ⅲ经脱保护试剂处理后脱掉侧链保护基Fmoc，然后和L-氢化乳清酸发生偶联反应，得到肽树脂IV：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-NH-Resins；(e)肽树脂IV经裂解、纯化、冻干得到地加瑞克精肽。2.根据权利要求1所述的固液结合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(a)中所述片段肽Ⅰ的合成方法为：将H-4Aph(Fmoc)-OH与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.9～1.0倍摩尔量(以H-4Aph(Fmoc)-OH的量计)Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OSu的有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(Fmoc)-OH；所述Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OSu的合成方法为：取Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OH与HOSu按摩尔比为1:1.0～1.2的比例溶解在THF中，冰浴下滴加入1.0～1.2倍Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OH摩尔量量(以Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OH的量计)的DCC的THF溶液，反应3-4h,滤除不溶物，滤液浓缩后加入石油醚，析出固体，得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OSu。3.根据权利要求2所述的固液结合制备地加瑞克的方法，其特征在于，所述Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OH的合成的方法为：以Ac-D-2Nal-OH和H-D-4Cpa-OH为原料，液相条件下偶联制备得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-OH；然后再和H-D-3Pal-OH液相条件下偶联制备得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH；随后再和H-Ser(tBu)-OH液相条件下偶联制备得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-OH。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，李同金，王仁友，石鑫磊，
申请(专利权)人：济南康和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37