猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释制造技术

本发明专利技术公开了猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释，包括以下步骤：第一步：选取肌内脂肪含量差异较大的皖南花猪(WH)和大约克猪(YY)作为研究对象，第二步：高通量miRNA‑seq测序技术，对miRNA‑seq数据进行差异表达分析，第三步：应用miRanda软件对miRNA预测中得到的序列以及对应物种的基因组cDNA序列进行可能的靶位点预测，并且通过采用DAVID KEGG分析在脂肪生成信号通路（Adipocytokine signaling pathway）中的差异表达miRNA及其预测的靶基因。

Screening and annotation of key miRNA related to intramuscular fat generation in porcine longissimus dorsi muscle

The invention discloses a screening and annotation of longissimus muscle intramuscular fat generation key miRNA, which comprises the following steps: the first step: select the differences in fat content in muscle of Wannanhua pig (WH) and Yorkshire (YY) as the research object, the second step: miRNA high-throughput SEQ sequencing technology. The miRNA SEQ data for differential expression analysis, the third step: miRanda software was used to predict target sites as possible for the prediction of miRNA sequence and genomic cDNA sequences corresponding to species, and through the use of DAVID KEGG analysis to generate signal pathway in fat (Adipocytokine signaling pathway) expression of target gene in miRNA and the difference between forecast.

【技术实现步骤摘要】
猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释
：本专利技术涉及生物养殖方法领域，特别涉及不同品种猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释。
技术介绍
：随着人们的生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求越来越高，如何在不降低生长速度的同时维持一个合适的肌内脂水平从而改良肉质已成为当前猪育种工作中的研究热点和难点。肌内脂肪含量是评定肉质优劣的一项尤其重要的指标，肉的风味、多汁性及嫩度随着肌内脂肪含量的增加而改善。中外猪种比较发现，国外猪种具有生长速度快、瘦肉率高和饲料转化率高等优点，但往往存在肌内脂肪少、肉色灰白和系水力低等缺点，我国地方猪种具有肉色鲜红、系水力强、肌内脂肪含量高和肌纤维直径小等优点。本试验选用肉质优良，但生长速度较慢的中国地方品种皖南花猪和生长速度快，但肉质较差的具有代表性的国外品种大约克猪作为研究对象，采用高通量miRNA-seq测序技术，对miRNA-seq数据进行差异表达分析；采用DAVIDKEGG分析在脂肪生成信号通路（Adipocytokinesignalingpathway）中的差异表达miRNA及其预测的靶基因。由于miRNA在众多生物过程的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此miRNA的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定miRNAs的方法是检测miRNA的表达谱，如果发现某一种miRNA在某种特定组织或细胞中特异性表达的话，此miRNA将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样，如果某一种miRNA在生物特殊发育阶段表达的话，则它有可能是调控发育进程一个主要分子。高通量测序技术既能捕捉真实存在的小RNA，同时也能对没有注释的小片段RNA进行预测，更重要的通量的增加甚至可以捕捉体内一些低表达的小RNA，在小RNA检测方面确实具有极大的优势，在人、鼠、牛、鸡、猪等物种上的miRNA-Seq都已有报道。例如：【英文作者】CaiZ1,ZhangL2,JiangX3,ShengY3,XuN4（1、CollegeofAnimalScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;LaboratoryAnimalResearchCenter,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China；2、CollegeofAnimalScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China；3、CollegeofAnimalScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China；4、CollegeofAnimalScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China.【机构】1、浙江大学，动物科学院；浙江中医药大学，动物研究中心实验室2、南京农业大学，动物科技技术院3、浙江大学，动物科学院4、浙江大学，动物科学院【刊名】ResVetSci【英文关键词】Castration;Expression;MicroRNA;Pig;Skeletalmuscle【中文关键词】阉割；表达；miRNA;猪；骨骼肌【摘要】在大多数哺乳动物中miRNAs在骨骼肌发育过程中起到重要的调节的作用，但是其在阉割的公猪的骨骼肌中的作用还没有研究。本试验的目的为鉴定阉割猪的背最长肌中miRNAs的作用。结果表明，阉割引起显著降低血清睾酮水平，但是会提高其脂肪含量。然而，在阉割后的骨骼肌中的miRNAs的表达谱的显著性分析发现7个显著性差异的miRNAs。更重要的，功能分析发现这些差异表达的miRNAs及其靶基因全都参与调节骨骼肌的收缩及脂肪代谢。总之，这些结果表明，阉割公猪的骨骼肌的改变的miRNA的表达，会是一个对阉割猪骨骼肌生长潜在的影响机制。此论文研究了阉割公猪的骨骼肌的改变的miRNA的表达。和：SiengdeeP1,TrakooljulN,MuraniE,SchwerinM,WimmersK,PonsuksiliS【机构】莱布尼茨农场动物生物学研究所（FBN,），功能基因组分析团队,德国【刊名】AnimGenet.【英文关键词】microRNA;microarray;muscledevelopment;pig;skeletalmuscle【中文关键词】miRNA；芯片；肌肉发育；猪；骨骼肌【摘要】miRNAs和mRNAs之间建立了一个复杂的调控网络来影响不同生物途径包括肌肉的发育和生长。阐明参与肌肉发育的miRNA调控网络能为胚胎发育过程中的肌肉发育提供更多的见解。本研究的目的为在两个猪种（德国兰德瑞斯和皮特兰）中鉴定差异表达谱及miRNA-mRNA与不同骨骼肌发育阶段的关联分析。利用AffymetrixGeneChip的猪基因组芯片分别对35天、63天和91天的仔猪的背最长肌进行比较转录谱的分析。差异表达谱与肌肉发育阶段和猪的品种有关。通过整合miRNA表达数据和及途径分析（IPA）通路的分析揭示了一些miRNA调控网络的肌肉生长和发育相关。本研究结果提供了深入了解肌肉生物学，为进一步改善猪的肉质提供理论依据。
技术实现思路
：本专利技术旨在介绍可能参与肌内脂肪生成时发挥重要作用的新的miRNA-196a/b的筛选与注释，miRNA-196a/b通过与其靶基因PPARGC-1结合以激活脂肪生成信号通路来影响猪肌内脂肪的形成的过程，将其应用于猪的肉质风味方面的选育过程中的辅助选择，以期改善猪肉的肉质提供理论依据。本专利技术采用的技术方案为：猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释，包括以下步骤：第一步：选取肌内脂肪含量差异较大的皖南花猪(WH)和大约克猪(YY)作为研究对象：高通量测序后皖南花猪3个样本得到的总reads数分别为20147696，25342611和24257436，其中Cleanreads达到98.9%、98.89%和98.97%；大约克猪3个样本得到的总reads数分别为26177403，28014381和23255427，其中Cleanreads达到98.9%、98.98%和99.02%；可见所测样品中Cleanreads的比例都占到Rawreads的98%以上，表明测序质量较高，所得Cleanreads数目能够满足试验需要；第二步：高通量miRNA-seq测序技术，对miRNA-seq数据进行差异表达分析：在差异分析中，采用TPM（Transcriptspermillion，公式为：单一miRNAreads数×106/总reads数）作为标准化数据；其中以大约克猪为对照组，皖南花猪与之相比，趋于红色的区域代表上调的有9个miRNA，趋于绿色的区域代表为下调的有33个miRNA（参见图1）；第三步：应用miRanda软件对miRNA预测中得到的序列以及对应物种的基因组cDNA序列进行可能的靶位点预测。并且通过采用DAVIDKEGG分析在脂肪生成信号通路（Adipocytokinesignalingpathway）中的差异表达mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释，其特征在于，包括以下步骤：第一步：选取肌内脂肪含量差异较大的皖南花猪(WH)和大约克猪(YY)作为研究对象：高通量测序后皖南花猪3个样本得到的总reads数分别为20147696，25342611和24257436，其中Clean reads达到98.9%、98.89%和98.97%；大约克猪3个样本得到的总reads数分别为26177403，28014381和 23255427，其中Clean reads达到98.9%、98.98%和99.02%；可见所测样品中Clean reads的比例都占到Raw reads的98%以上，表明测序质量较高，所得Clean reads数目能够满足试验需要；第二步：高通量miRNA‑seq测序技术，对miRNA‑seq数据进行差异表达分析：在差异分析中，采用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×106/总reads数）作为标准化数据；其中以大约克猪为对照组，皖南花猪与之相比，趋于红色的区域代表上调的有9个miRNA，趋于绿色的区域代表为下调的有33个miRNA（参见图1）；第三步：应用miRanda软件对miRNA预测中得到的序列以及对应物种的基因组cDNA序列进行可能的靶位点预测，并且通过采用DAVID KEGG分析在脂肪生成信号通路（Adipocytokine signaling pathway）中的差异表达miRNA及其预测的靶基因（参见图2）：研究发现，两个上调的miRNA‑196a/b可能通过与其预测的靶基因...

【技术特征摘要】
1.猪背最长肌肌内脂肪生成相关的关键miRNA的筛选与注释，其特征在于，包括以下步骤：第一步：选取肌内脂肪含量差异较大的皖南花猪(WH)和大约克猪(YY)作为研究对象：高通量测序后皖南花猪3个样本得到的总reads数分别为20147696，25342611和24257436，其中Cleanreads达到98.9%、98.89%和98.97%；大约克猪3个样本得到的总reads数分别为26177403，28014381和23255427，其中Cleanreads达到98.9%、98.98%和99.02%；可见所测样品中Cleanreads的比例都占到Rawreads的98%以上，表明测序质量较高，所得Cleanreads数目能够满足试验需要；第二步：高通量miRNA-seq测序技术，对miRNA-seq数据进行差异表...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘林清，王重龙，钱坤，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34