一种生长抑素28肽多克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生长抑素28肽多克隆抗体及其制备方法。所述生长抑素28肽的多克隆抗体是将血蓝蛋白KLH作为载体蛋白进行羧基活化，再与生长抑素28肽中的氨基偶联，作为免疫抗原去免疫兔子，从兔子的血液中提取血清蛋白并纯化得到。所述纯化的方法为饱和硫酸铵沉淀法或辛酸‑硫酸铵法。所述生长抑素28肽多克隆抗体的效价达到1：128000，特异性好、纯度高、制备方法简便，可以大量生产，在制备酶联免疫试剂盒以检测生长抑素类药物疫苗中生长抑素的定性检测上的应用前景广泛。

Somatostatin 28 peptide polyclonal antibody and preparation method thereof

The invention discloses a somatostatin 28 peptide polyclonal antibody and a preparation method thereof. Polyclonal antibodies of the somatostatin peptide 28 is hemocyanin KLH as carrier protein and amino carboxyl activation, coupling of somatostatin 28 peptides, as immune antigen to immune rabbit serum protein extracted from rabbit blood and purified. The method for purification of saturated ammonium sulfate precipitation or octanoic acid ammonium sulfate method. The titer of the somatostatin 28 peptide polyclonal antibody to 1:128000, good specificity, high purity, simple preparation method, mass production, preparation of ELISA kit for the detection of growth and wide application prospect of qualitative detection of somatostatin on statin drugs in preparation of vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种生长抑素28肽多克隆抗体及其制备方法
本专利技术属于生物制药和免疫学检测领域，更具体地，涉及一种生长抑素28肽多克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
生长抑素28肽是化学合成的一种环状多肽，其C端含SS-14的完整顺序，N端有另外14肽的延伸，其分子顺序为：丝—丙—门酰—丝—门酰—脯—丙—甲硫—丙—脯—精—谷—精—赖—SS-14。与抑制人生长激素释放的下丘脑激素结构相同，生长抑素28肽(SS-28)是作用比较广泛的一种神经激素，它的主要作用是抑制垂体生长激素(GH)的基础分泌，也抑制腺垂体对多种刺激所引起的GH分泌反应，包括运动、进餐、应激、低血糖等，其最初是从猪小肠和牛下丘脑中分离出的。近年来，随着动物生理生化理论研究的不断发展，发现日粮营养水平、饲养管理及环境等外因对动物的生长促进作用最终通过体内神经内分泌系统的整合来实施，生长抑素基因免疫将成为促进动物生长的新途径。因此，制备出针对生长抑素28肽的抗体，为检测SS-28基因疫苗或血清的有效性、研究SS-28蛋白或基因疫苗的作用规律、给药途径和作用机理等方面提供事实依据和评定标准。已采用生长抑素28肽与牛血清蛋白(BSA)偶联制备抗体的报道，但是用BSA作为载体蛋白的不利之处在于，很多实验用它当做封闭剂和包被抗原的偶联载体，如果多肽-BSA偶联物的抗体用于这样的检测分析中，通常会出现假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法。该方法是将羧基活化后的血蓝蛋白KLH，人工偶联到28肽的生长抑素半抗原的氨基，制得的完全抗原作为免疫抗原，免疫兔子，提取血清蛋白得到生长抑素28肽多克隆抗体粗品，经饱和硫酸铵沉淀或辛酸-硫酸铵法纯化血清蛋白后，得到生长抑素28肽多克隆抗体。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述方法制备的生长抑素28肽多克隆抗体。该生长抑素28肽的多克隆抗体是将血蓝蛋白KLH作为载体蛋白进行羧基活化，再与生长抑素28肽中的氨基偶联，作为免疫抗原去免疫兔子，从兔子的血液中提取血清蛋白并纯化得到。该生长抑素28肽多克隆抗体具有纯度高，免疫性能好，特异性强的优点。本专利技术的再一个目的在于提供上述生长抑素28肽多克隆抗体的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：一种生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，包括具体步骤如下：S1.免疫抗原的制备：(1)将血蓝蛋白KLH和生长抑素28肽分别用PBS溶解，(2)在PBS溶解后的血蓝蛋白KLH溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺并调整pH为7～8，室温下反应15～30min，得到血蓝蛋白KLH处理液；(3)将PBS溶解后的生长抑素28肽溶液调整pH值为7～8，滴加血蓝蛋白KLH处理液中，在室温状态下搅拌反应1～3h，PBS透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末，并于-20℃保存备用；(4)将血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末用PBS溶解，制得免疫抗原；S2.免疫：先用免疫抗原和弗氏完全佐剂佐剂混合乳化后，采用颈部多点皮下注射免疫兔子，28天后用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，每隔14天后再加强免疫，共加强免疫四次；S3.抗体粗品的制备：在步骤S2中首次免疫28天后和加强免疫7天后分别对兔耳部静脉取血，所取血液均在4℃下静置16～24h，离心后取上清液为含有生长抑素28肽多克隆抗体的血清蛋白，即得生长抑素28肽多克隆抗体粗品；S4.将生长抑素28肽多克隆抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素28肽多克隆抗体。优选地，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH和PBS的质量体积比为1：1mg/mL，所述生长抑素28肽与PBS的质量体积比为1：1mg/mL；步骤S1中(2)所述血蓝蛋白KLH、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.5～1)：(1.5～2)；步骤S1中(4)所述血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末与PBS的质量体积比为1：1mg/mL。优选地，步骤S2中所述免疫抗原与弗氏完全佐剂的体积比为1：1～2，所述弗氏完全佐剂佐剂与弗氏不完全佐剂的体积比为1～2：1，所述免疫抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为1：1。步骤S4中所述提纯的方法包括如下具体步骤：S11.将血清蛋白用PBS稀释后，滴加饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液的浓度为50％，搅拌后静置，离心后取沉淀，S12.用PBS溶解沉淀后，继续滴加饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液的浓度为33％，搅拌后离心，沉淀用PBS溶解，透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素28肽多克隆抗体；或者，S21.将血清蛋白用醋酸-醋酸钠缓冲液稀释，滴加辛酸，搅拌，离心取上清液，S22.上清液用PBS稀释后，再滴加饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液的浓度为45％，搅拌后离心，得到的沉淀用PBS溶解，透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素28肽多克隆抗体。优选地，步骤S11中所述血清蛋白和PBS的体积比为1：8～10，所述血清蛋白和饱和硫酸铵溶液的体积比为1：9～11，所述搅拌的时间为30～60min，所述静止的时间为16～24h；所述滴加的速率为200～400μL/秒。优选地，步骤S12中所述沉淀与PBS的质量体积比为1：5～10mg/ml，所述PBS与饱和硫酸铵的体积比为1：0.6～0.4，所述冻干的温度为-40～-80℃，所述冻干的时间为10～20h，所述滴加的速率为200～400μL/秒。优选地，步骤S21中所述血清蛋白、醋酸-醋酸钠缓冲液和辛酸的体积比为1：(4～6)：40，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为40～100mmol/L，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为4.0～5.6，所述滴加的速率为40～80μL/秒。优选地，步骤S22中所述上清液和PBS的体积比为1：(1～1.2)，所述上清液和饱和硫酸铵体积比为1：(1.5～2)，所述冻干的温度为-40～-80℃，冻干的时间为10～20h，所述滴加的速率为200～400μL/秒。上述方法制备的生长抑素28肽的多克隆抗体及其在制备酶联免疫试剂盒以检测生长抑素类药物疫苗中生长抑素的定性检测上的应用。本专利技术采用血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，该载体蛋白是在某些软体动物、节肢动物的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白。其分子量450000～130000。由于生长抑素28肽的分子量只有约2400，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。另外血蓝蛋白KLH作为载体蛋白的免疫原性比起经常用到的BSA、OVA强，可偶联的基团也较多，还能克服BSA作为载体蛋白的不利之处，例如很多实验用它当做封闭剂和包被抗原的偶联载体，如果多肽-BSA偶联物的抗体用于这样的检测分析中，通常会出现假阳性。将血蓝蛋白KLH作为半抗原的载体蛋白与生长抑素28肽中的氨基偶联，使制备的抗体具有更好的免疫活性和特异性。其人工抗原合成的机理如式(1)所示，R1为血蓝蛋白KLH，属于天然高分子化合物，式1中只表示出它的羧基末端，R2为生长抑素28肽的半抗原，同样只表示出氨基末端(赖氨酸上)。载体蛋白KLH的羧基末端先与碳二亚胺反应生成中间体O-酰基异脲，类似于引入酯基活化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括具体步骤如下：S1.免疫抗原的制备：(1)将血蓝蛋白KLH和生长抑素28肽分别用PBS溶解，(2)在PBS溶解后的血蓝蛋白KLH溶液中加入碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺并调整pH为7～8，室温下反应15～30min，得到血蓝蛋白KLH处理液；(3)将PBS溶解后的生长抑素28肽溶液调整pH值为7～8，滴加血蓝蛋白KLH处理液中，在室温状态下搅拌反应1～3h，PBS透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH‑生长抑素28肽固体粉末，并于‑20℃保存备用；(4)将血蓝蛋白KLH‑生长抑素28肽固体粉末用PBS溶解，制得免疫抗原；S2.免疫：先用免疫抗原和弗氏完全佐剂佐剂混合乳化后，采用颈部多点皮下注射免疫兔子，28天后用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，每隔14天后再加强免疫，共加强免疫四次；S3.抗体粗品的制备：在步骤S2中首次免疫28天后和加强免疫7天后分别对兔耳部静脉取血，所取血液均在4℃下静置16～24h，离心后取上清液为含有生长抑素28肽多克隆抗体的血清蛋白，即得生长抑素28肽多克隆抗体粗品；S4.将生长抑素28肽多克隆抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素28肽多克隆抗体。...

【技术特征摘要】
1.一种生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括具体步骤如下：S1.免疫抗原的制备：(1)将血蓝蛋白KLH和生长抑素28肽分别用PBS溶解，(2)在PBS溶解后的血蓝蛋白KLH溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺并调整pH为7～8，室温下反应15～30min，得到血蓝蛋白KLH处理液；(3)将PBS溶解后的生长抑素28肽溶液调整pH值为7～8，滴加血蓝蛋白KLH处理液中，在室温状态下搅拌反应1～3h，PBS透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末，并于-20℃保存备用；(4)将血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末用PBS溶解，制得免疫抗原；S2.免疫：先用免疫抗原和弗氏完全佐剂佐剂混合乳化后，采用颈部多点皮下注射免疫兔子，28天后用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，每隔14天后再加强免疫，共加强免疫四次；S3.抗体粗品的制备：在步骤S2中首次免疫28天后和加强免疫7天后分别对兔耳部静脉取血，所取血液均在4℃下静置16～24h，离心后取上清液为含有生长抑素28肽多克隆抗体的血清蛋白，即得生长抑素28肽多克隆抗体粗品；S4.将生长抑素28肽多克隆抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素28肽多克隆抗体。2.根据权利要求1所述生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH和PBS的质量体积比为1：1mg/mL，所述生长抑素28肽与PBS的质量体积比为1：1mg/mL；步骤S1中(2)所述血蓝蛋白KLH、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.5～1)：(1.5～2)；步骤S1中(4)所述血蓝蛋白KLH-生长抑素28肽固体粉末与PBS的质量体积比为1：1mg/mL。3.根据权利要求1所述生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述免疫抗原与弗氏完全佐剂的体积比为1：1～2，所述弗氏完全佐剂佐剂与弗氏不完全佐剂的体积比为1～2：1，所述免疫抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为1：1。4.根据权利要求1所述的生长抑素28肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述提纯的方法包括如下具体步骤：S11.将血清蛋白用PBS稀释后...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，梁雨昕，吕瑞，夏娜娜，谢昭生，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44