尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，包括如下步骤：样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1‑2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1‑3，得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。上述检测方法的定量限为0.0975μg/L，检测限为0.0249μg/L，精密度RSD<11％，加标回收率在89％‑110％之间，前处理时间约1.2min，检测效率高，精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。

Method for determination of melatonin sulfate in urine

The invention relates to a detection method of urine melatonin sulfate, which comprises the following steps: the preparation of the sample: urine samples, deionized water dilution, the urine sample and the deionized water volume ratio of 1:1 2; then adding internal standard solution, the urine sample with the internal standard solution the volume ratio of 1:1 3 samples to be tested; enrichment, separation and detection of the sample to be detected by two-dimensional liquid chromatography MS enrichment, separation and detection of four tandem mass spectrometry. The quantitative detection limit was 0.0975 g/L, the detection limit is 0.0249 g/L, the precision of RSD< 11%, the recovery rate was between 89% and 110% standard, the pretreatment time is about 1.2min, high detection efficiency, high precision, high sensitivity, high throughput detection and low cost.

【技术实现步骤摘要】
尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法
本专利技术涉及分析检测
，特别是涉及一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法。
技术介绍
尿液中褪黑素硫酸盐(MT6s)是褪黑素的主要代谢产物，通过检测尿液中MT6s可以间接反映人体内MT水平。褪黑激素(Melatonine，MT)因为能使皮肤变白而得名，是由脑松果体分泌的激素之一。褪黑激素属于吲哚杂环类化合物，其化学名是N-乙酰基-5-甲氧基色胺，又称为松果体素、褪黑素。褪黑素合成后，储存在松果体内，交感神经兴奋支配松果体细胞释放褪黑素人血。褪黑素的分泌具有明显的昼夜节律，白天分泌受抑制，晚上分泌活跃。褪黑素可抑制下丘脑-垂体-性腺轴，使促性腺激素释放激素、促性腺激素、黄体生成素以及卵泡雌激素的含量均减低，并可直接作用于性腺，降低雄激素、雌激素及孕激素的含量。另外，MT有强大的神经内分泌免疫调节活性和清除自由基抗氧化能力，可能会成为新的抗病毒治疗的方法和途径。MT最终在肝脏中代谢，肝细胞的损伤可影响体内MT的水平。目前尿液中褪黑素硫酸盐检测主要采用传统的放免法、酶联免疫、化学发光或者液相色谱的方法检测尿液样本中的褪黑素硫酸盐，鲜少有液相色谱串联质谱法，且普遍存在：1.尿液样本的运输和保存条件严格运输不方便；2.褪黑素硫酸盐浓度较低一般为ppb级别，且极性强，人体尿液组成复杂存在大量的结构相似的化合物，因此传统方法检测存在严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低，准确度低等缺点。3.色谱或者质谱法存在前处理复杂，操作繁琐，周期长，检测通量小。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、通量高的褪黑素硫酸盐的检测方法。具体的技术方案如下：一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，包括如下步骤：样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1-2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1-3，得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；其中，富集柱为C8柱，分析柱为C18柱；流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.0-2.0ml/min；流动相2：C相为含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，D相为含0.09-0.2wt％甲酸和5-10mM醋酸铵的水，流速为0.2-1.0ml/min。所述的二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪配置了两套泵，两套泵通过六通阀(或者其它可实现切换的方式)实现切换。起始模式下，富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化后，0.25min切换六通阀使富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，0.8min六通阀切回起始模式，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱至废液瓶中。在其中一些实施例中，流动相采用梯度洗脱模式：0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为98:2，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.25min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱；0.3min时，流动相2中C相与D相的体积比为70:30；0.3min-0.5min时，流动相2中C相与D相的体积比由70:30变化至50:50；0.8min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；1.6min时，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；1.6min-3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比由50:50变化至37:63；3.1min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；3.7min时，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；整个梯度时间为4.5-7.0min。在其中一些实施例中，所述流动相1的流速为1.2-1.3ml/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6ml/min。在其中一些实施例中，所述内标液为含10-50μg/L内标物的乙腈溶液；所述内标物为褪黑素的C13标记物或氘代标记物。在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；所述正离子模式中，目标定量离子对包括褪黑素D4定量离子对和/或褪黑素硫酸盐定量离子对；目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：褪黑素硫酸盐的母离子的质/荷比为328.9-329.5，对应的子离子的质/荷比为189-191；褪黑素D4的母离子的质/荷比为236.8-237.5，对应的子离子的质/荷比为177.8-178.5。在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为35-45psi，加热气压力为35-45psi，辅助加热气压力为55-65psi，加热气温度为450-550℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为6.0-8.0psi，电喷雾针电压为5000-6000V。在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括：尿液中褪黑素硫酸盐定量离子对的去簇电压为70-90V，入口电压为8-12V，碰撞电压为25-35V，出口电压为8-12V；褪黑素D4的定量离子对的去簇电压为60-70V，入口电压为6-10V，碰撞电压为6-15V，出口电压为18-25V。在其中一些实施例中，所述样品前处理步骤为：取尿液样品，将滤纸片浸入所述尿液样品中，取出，晾干，得尿纸片；用去离子水洗脱所述尿纸片得洗脱液，于所述洗脱液中加入所述内标液混匀，离心得待测样品；所述洗脱液与所述内标液的体积比为1:1-3。在其中一些实施例中，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间4-8min。上述尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法具有以下优点和有益效果：(1)上述检测方法的样品前处理步骤简单只需将尿液样品稀释后即可上机，不需要萃取，氮吹浓缩，复溶等，处理时间短，处理单个样本只需1.0-2.5min，处理一批(20个)也只需要3-10min，而常用的萃取法处理单个样本至少需90min，处理一批(20个)也至少需要120min。即本专利技术的检测方法大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量。(2)上述检测方法在仪器投入方面比普通的液相色谱串联四级杆质谱仪仅增加了一个富集柱和一组泵起到了提纯，浓缩的效果，并且采用的富集柱简单、成本低且可重复使用数千次以上，大大提高了检测效率、灵敏度、精密度等。(3)上述检测方法富集、分离和检测的各参数(比如富集柱的选择、流动相的选择、流速等条件)进行了大量实验研究进行优化，使最后得到的检测方法可以有效去除基质干扰，特异性、抗基质干扰能力强。定量限低(<0.975ng/L)，灵敏度高，精密度RSD小于10％，可以准确本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1‑2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1‑3，得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。

【技术特征摘要】
1.一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1-2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1-3，得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。2.根据权利要求1所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；其中，富集柱为C8柱，分析柱为C18柱；流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.0-2.0ml/min；流动相2：C相为含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，D相为含0.09-0.2wt％甲酸和5-10mM醋酸铵的水，流速为0.2-1.0ml/min。3.根据权利要求2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，流动相采用梯度洗脱模式：0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为98:2，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.25min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱；0.3min时，流动相2中C相与D相的体积比为70:30；0.3min-0.5min时，流动相2中C相与D相的体积比由70:30变化至50:50；0.8min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；1.6min时，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；1.6min-3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比由50:50变化至37:63；3.1min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；3.7min时，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；整个梯度时间为4.5-7.0min。4.根据权利要求2所述的尿液中褪黑素硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：何翠红，李玉冬，梁田，苗季，谢诗诚，陈栢健，熊晓明，
申请(专利权)人：博厚健康科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44