一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，其用于检测273个SNP位点(234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上)，该检测试剂盒包含由273个SNP位点的引物对组成的引物组合物，该引物组合物的序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：546所示；本发明专利技术还提供一种采用上述试剂盒的检测方法及上述试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。本发明专利技术利用了高通量测序技术对SNP位点进行并行测序，在读取位点信息的同时可以获取侧翼序列变异信息；单次测序可以获取多达384个样本在273个SNP位点的序列信息，节约DNA样本量及检测时间；片段文库集中于200bp以下，适用于法医学降解检材。

Detection kit for SNP loci based on high throughput sequencing and detection method thereof

The invention relates to a kit for detecting SNP loci of high-throughput sequencing based on the detection for 273 SNP loci (234 in autosomal, 9 located on the Y chromosome, 30 located on the X chromosome), the detection kit contains 273 SNP loci by primer primer composition. The composition of the primer sequence, as shown in SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:546; the invention also provides an application using the kit detection method and the kit in three parentage identification, parentage identification, identification of two generations, and the individual identification of sibling identification in the field of judicial identification. The invention makes use of high-throughput sequencing of SNP loci were sequenced in parallel at the same time, read the site information can obtain the flanking sequence variation information; single sequencing can get up to 384 samples in the sequence of 273 SNP loci, saving DNA sample and detection time; fragment library focused on the following 200bp, suitable for forensic study of degraded.

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于法医遗传学领域，涉及检测人类基因组中具有良好法医学应用价值的SNP遗传标记，具体涉及一种基于高通量并行测序技术的273个SNP位点的检测试剂盒及其应用和检测方法。
技术介绍
基于毛细管电泳技术(CapillaryElectrophoresis,CE)的PCR-STR复合荧光扩增检测是目前采用的主要技术手段。其中，STR基因座由于多态性高、检测技术均一等优点被认为是法医DNA鉴定中通用性最高的遗传标记。目前，法医学DNA数据库大部分均围绕STR基因座展开。但是，随着STR基因座在法医DNA分析中的广泛应用，其缺陷也日益受到学界关注。如STR基因座的高突变率不利于亲权鉴定的结果解释；PCR扩增子较长不易实现对降解检材的DNA分型；STR基因座的数量有限不利于复杂亲缘关系的鉴定等；CE技术中目前可供选择的荧光素数量有限，无法实现大量STR基因座的并行检测。SNP(SingleNucleotidePolymorphism,单核苷酸多态性)作为第三代遗传标记，应用于法医学实践的优越性已越发显著。与STR(自发突变率为10-3～10-5)相比，SNP具有相对较低的自发突变率(10-8)；而单个的SNP位点扩增产物可以控制在200bp以下，容易实现多个位点的复合扩增，并有利于降解检材的分型；二等位基因的特性也使其分型结果的分析简便易行，更加容易完成向自动化的转变。然而SNP分型采用的技术平台无论是Minisequencing(核心是单碱基延伸)、连接反应还是质谱分析，均最多只能完成几十个遗传标记的并行检测，获取有效信息的能力受限。高通量并行测序技术(MassivelyParallelSequencing,MPS)，为解决这一科学问题提供了方法学上的前景：与传统的CE技术相比，MPS技术可以对多达几千个SNP进行并行检测，节约检测样本量及检测时间；与Barcode技术相结合，可以对多样本并行检测；文库构建时依赖PCR技术，但无需电泳及荧光标记，可将引物设计的尽可能短，进一步提高降解检材的分型成功率；对序列内部碱基的深度读取，可提高法医学混合样本的分析能力。美国ThermoFisherScientific公司在IonTorrentPGMTM测序平台已推出两款商业化SNP检测试剂盒，一是用于个体识别的“PrecisionIDIdentityPanel”，试剂盒中共含有124个SNP位点，主要针对欧洲人群，部分位点在中国人群中多态性差；另一个是用于族源信息推断的“PrecisionIDAncestryPanel”，不适用于个体识别和亲缘鉴定。美国Illumina公司在Miseq平台上推出可同时检测STR和SNP遗传标记的检测试剂盒ForenSeqDNASignature，其中含有95个用于个体识别的SNP位点，24个用于表型鉴定的位点，56个先祖SNP位点。上述SNP位点的筛选基于欧洲人群，在中国人群中检测效能受限，同样无法满足法医学个体识别和亲缘鉴定的需求。另外，以往针对法医学SNP位点的研究及相关专利申请，均集中于最多几十个SNP的检测体系构建，且集中针对一类染色体进行标记的检测(常染色体，X染色体或者Y染色体)。因此，建立一套针对中国人群并覆盖人类全基因组的高多态性SNP检测体系，用于满足个体识别及亲权鉴定的需求，并为复杂疑难案件的解决提供更多的技术检测手段具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于高通量测序平台的可同时检测273个覆盖人类基因组SNP遗传标记的检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术提供一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，该检测试剂盒用于检测273个SNP位点，其中所述273个SNP位点中的234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述273个SNP位点信息如表1所示。优选地，该检测试剂盒包含由273个SNP位点的引物对的引物组合物，所述引物组合物的序列如SEQIDNO：1-SEQIDNO：546所示。该SNP位点的扩增引物序列如表2所示。表1：本试剂盒中所包含的SNP位点信息表2：本试剂盒中273个SNP位点的扩增引物序列优选地，该检测试剂盒还包括自行编写的BED文件，所述BED文件用于SNP位点的结果分析；该BED文件可用于高通量测序仪测序软件(或插件)使用，或采用自行编写插件进行273个SNP位点的分型。该BED文件如下：另一方面，本专利技术提供一种上述SNP位点的检测试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。最后，本专利技术还提供一种上述SNP位点的检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：步骤1)取样本DNA于PCR扩增体系中，采用聚合酶链式反应进行文库的构建；步骤2)对步骤1)中构建的文库进行纯化和定量；步骤3)对步骤2)定量后的文库进行接头和测序引物的连接；步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台完成测序；步骤5)采集测序信号，采用自行编写的BED文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述样本DNA采集于血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)、毛发、组织等人类生物检材；或者，可选的，所述样本DNA为标准品，如女性标准品DNA9947A，男性标准品9948等。优选地，所述步骤1)中PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、如SEQIDNO：1-SEQIDNO：546所示序列的引物组合物、Taq聚合酶以及去离子水。优选地，所述步骤1)中聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。优选地，所述步骤2)中的纯化采用Ampure磁珠完成，所述步骤2)中的定量可采用Qubit或qPCR方式。优选地，所述步骤4)中的高通量测序平台包括IonTorrent或者Miseq。优选地，所述步骤5)中的结果分析为针对FASTA格式测序信息采用自行编写插件进行273个SNP位点的结果分型。本专利技术所述试剂盒包含的273个SNP位点分别位于常染色体(234个)、Y染色体(9个)、X染色体(30个)，在中国主要人群中均具有良好的遗传多态性和个体识别能力，其中常染色体SNP位点在各染色体上平均分配，位点之间的平均物理距离约为10Mb。灵敏度检测显示，10-1ngDNA进行文库构建时，分型成功率为100％。试剂盒中含有的234个常染色体SNP位点组成的检测系统用于个体识别的累积个体识别率为1-1.49E-62，用于二联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-2.98E-12，用于三联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-3.51E-23，非常适合在法医学个体识别和亲缘鉴定中应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：(一)试剂盒中SNP位点的选择原则(1)筛选SNP数据库：HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)、1000Genomes(http://www.1000g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，包含由273个SNP位点的引物对组成的引物组合物，所述引物组合物的序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：546所示；其中，所述273个SNP位点中的234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，包含由273个SNP位点的引物对组成的引物组合物，所述引物组合物的序列如SEQIDNO：1-SEQIDNO：546所示；其中，所述273个SNP位点中的234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上。2.根据权利要求1所述的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括自行编写的BED文件，所述BED文件用于SNP位点的结果分析。3.一种如权利要求1-2中任一项所述的SNP位点的检测试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。4.一种使用权利要求1～2中任一项所述的SNP位点的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)取样本DNA于PCR扩增体系中，采用聚合酶链式反应进行文库的构建；步骤2)对步骤1)中构建的文库进行纯化和定量；步骤3)对步骤2)定量后...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成涛，张素华，边英男，刘希玲，
申请(专利权)人：司法部司法鉴定科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31