一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法。所述的配对微流控芯片为高通量捕获单微球/单细胞的微流控芯片，所述的方法包括：a、高通量配对捕获单微球/单细胞；b、对配对单元平行操控，如对大量单细胞的隔离、培养、裂解等，单细胞各种内含物的捕获等；c、通过编码微球将单细胞内含物信息转化为DNA序列信息，利用高通量测序技术和生物信息学方法分析大量单细胞内含物，如转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。本方法可以全面完整的分析单细胞内含物信息，具有通量高，准确性高，成本低，可分析靶标广等优点。

A method for high-throughput analysis of single cell inclusions using paired microfluidic chips

The present invention relates to a method for high-throughput analysis of single cell inclusions using paired microfluidic chips. The pairing of microfluidic chip for high-throughput single-cell capture single microsphere / microfluidic chip, the method comprises the following steps: A, high-throughput paired single / single cell capture microspheres; B, paired unit parallel control, such as a large number of single cell isolation and culture, cracking, single cell variety the contents of capture; C, by single cell inclusion microspheres encoding information into DNA sequence information, analysis of a large number of single cell inclusions using high-throughput sequencing and bioinformatics methods, such as transcriptome and genome, miRNA, protein, DNA, methylated metabolites, phospholipid liposome, etc.. This method can completely and completely analyze the information of single cell inclusion, and has the advantages of high throughput, high accuracy, low cost and wide analysis target.

【技术实现步骤摘要】
一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法
本专利技术涉及分子细胞生物学，具体涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的技术。
技术介绍
分析细胞内含物是分子生物学研究的基础，也是现代医疗诊断的分析靶标。传统分析细胞内含物的方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊了人们对单细胞之间异质性的认识。目前前沿生物学研究和医学研究表明，同一个体的不同组织之间，同一组织的不同部位之间，以及同一部位的不同细胞之间都存在异质性(heterogeneity)，即使是同一种细胞的不同个体之间也可能存在很大的异质性，这差异最大的这些细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示癌症等重大疾病。因此单细胞的全面分析是现代生物学和医学研究十分需要的技术。对单细胞分析来说，其面临的挑战主要有三点，首先是快速高效地分离单细胞，防止单细胞的丢失；其次是由于单细胞中所含有的分析靶标量太少，如何无偏放大靶标的信号，减少或者消除放大偏差性，真实反应细胞内含物的表达水平；再次是提高单细胞分析的通量，减少重复操作，提高效率；最后是如何实现单细胞内含物的全面分析，分析各种内含物的表达量以及相互之间的关联。目前尚无能够将高通量捕获单细胞、无偏扩增微量单细胞内含物、全面分析单细胞内含物集成在一起的公开技术。但已有公开报道利用微流控技术高通量分析单细胞转录组。比如Cell文章(Macoskoetal.，2015,Cell：161，1202-1214；Kleinetal.,2015,Cell161,1187-1201)报道的结合液滴微流控和编码微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配对捕获单细胞与单微球，单细胞裂解释放的mRNA被与之配对的编码微球捕获，再经过逆转录和扩增，将单细胞mRNA信息编码与放大，通过高通量测序与生物信息学方法分析大量大细胞mRNA的表达情况。该方法中细胞与微球的捕获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少部分细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外该策略只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/mL血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。这些技术都仅限于分析单细胞的mRNA，其他单细胞内含物无法进行分析，如基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。目前公开的技术中，都没有涉及到高通量分析。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，为了解决以上问题，本专利技术的目的在于：利用申请人发展的配对微流控芯片，基于流体力学原理和尺寸效应高通量捕获单细胞，结合编码技术和高通量测序技术，提供一种高通量分析单细胞内含物的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术公开了一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括步骤：首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道(10，11)和连接通道(13)，控制层包括隔离通道(12)；其中每个捕获通道由多个捕获单元(8，9)首尾串接而成，每个单元包括流道(10，11)、储液腔室(14，15)、捕获通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的液体出口端；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；连接通道(13)连接两个捕获单元的储液腔室(14，15)；隔离通道(12)层位于连接通道(13)下方或上方，垂直于连接通道(13)并由隔膜(18)隔离开；两个流道分别含有一个样品入口(1，2)、一个油相入口(4，5)以及一个出口(6，7)，隔离通道含有一个入口(3)。a、在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞悬浮液，当单细胞进入捕获单元(8)时，因为流体从流道(10)经过的路径大于从储液腔室(14)，细胞会先进入储液腔室(14)，由于捕获通道(16)小于细胞，细胞被卡在捕获通道(16)前，同时堵住捕获通道(16)，流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，此时后续的细胞无法再次进入该储液腔室(14)，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞的捕获。在后续的微球/细胞捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单细胞的捕获。b、保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，与步骤a类似可以在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获。具体过程如下：从通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，当单个微球进入捕获单元(9)时，因为流体从流道(11)经过的路径大于从储液腔室(15)，微球会先进入储液腔室(15)，由于捕获通道(17)小于微球，微球被卡在捕获通道(17)前，同时堵住捕获通道(17)，流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，此时后续的微球无法再次进入该储液腔室(15)，只能通过流道(11)进入下一个捕获单元。在后续的微球捕获单元中重复该过程，即可实现该流道内高通量单微球的捕获。同时实现了两个单微球/细胞的高通量配对捕获。c、保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球。d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液。e、保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道(10)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(10)而不进入捕获通道(16)并将溶液从捕获腔室(14)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当油相流通完整个芯片时，所有的单细胞均被隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。f、保持连接通道(13)关闭状态，在e步骤进行的同时，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道(11)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(11)而不进入捕获通道(17)并将溶液从捕获腔室(15)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，这样就实现了在并行的捕获通道中的单微球隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。g、关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括如下步骤：首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道(10，11)和连接通道(13)，控制层包括隔离通道(12)；其中每个捕获通道由多个捕获单元(8，9)首尾串接而成，每个单元包括流道(10，11)、储液腔室(14，15)、捕获通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的液体出口端；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；连接通道(13)连接两个捕获单元的储液腔室(14，15)；隔离通道(12)层位于连接通道(13)下方或上方，垂直于连接通道(13)并由隔膜(18)隔离开；两个流道分别含有一个样品入口(1，2)、一个油相入口(4，5)以及一个出口(6，7)，隔离通道含有一个入口(3)；a、在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞悬浮液，各捕获单元(8)捕获单细胞；b、保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获；c、保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球；d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液；e、保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，储液腔室内形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中；f、保持连接通道(13)关闭状态，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，储液腔室形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，形成独立的反应单元；g、关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液或者反应溶液B扩散到细胞储液腔室(14)将细胞裂解，释放单细胞中的内含物，且内含物通过扩散作用进入微球捕获腔室，与反应溶液A和微球一起充分接触后被捕获或者反应，单细胞中的内含物反应后被微球全部捕获，完成所有单微球对与其配对的单细胞的内含物的单独捕获；h、打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液，将未被捕获的其他物质洗去；将捕获层与控制层剥离开，回收捕获通道中的微球，然后再次用洗涤溶液清洗微球，进一步除去溶液中未结合的其他物质；i、配制连接酶反应溶液，将微球分散在酶反应溶液中，将微球上的编码信息与所捕获的内含物通过酶反应连接在一起形成编码内含物信息，用洗涤溶液对清洗完成酶反应的微球进行洗涤；j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反应溶液，将经过酶反应的微球分散在核酸外切酶I反应溶液中反应，切割去掉多余的单链编码引物，保留编码内含物信息，然后用洗涤溶液洗涤微球，将微球分散在缓冲溶液中；k、建库测序：配制PCR反应溶液，将微球分散在PCR反应溶液中对编码内含物信息进行PCR扩增，微球上的编码内含物信息被扩增到溶液中，对扩增产物进行纯化并定量；用纯化后的扩增产物进行DNA文库构建并测序；l、生物信息学分析：分析得到的高通量测序结果，根据编码分析物信息对单细胞中的内含物进行定量分析，绘制针对内含物的单细胞分子生物学图谱。...

【技术特征摘要】
1.一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括如下步骤：首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道(10，11)和连接通道(13)，控制层包括隔离通道(12)；其中每个捕获通道由多个捕获单元(8，9)首尾串接而成，每个单元包括流道(10，11)、储液腔室(14，15)、捕获通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的液体出口端；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；连接通道(13)连接两个捕获单元的储液腔室(14，15)；隔离通道(12)层位于连接通道(13)下方或上方，垂直于连接通道(13)并由隔膜(18)隔离开；两个流道分别含有一个样品入口(1，2)、一个油相入口(4，5)以及一个出口(6，7)，隔离通道含有一个入口(3)；a、在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞悬浮液，各捕获单元(8)捕获单细胞；b、保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获；c、保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球；d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液；e、保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，储液腔室内形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中；f、保持连接通道(13)关闭状态，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，储液腔室形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，形成独立的反应单元；g、关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液或者反应溶液B扩散到细胞储液腔室(14)将细胞裂解，释放单细胞中的内含物，且内含物通过扩散作用进入微球捕获腔室，与反应溶液A和微球一起充分接触后被捕获或者反应，单细胞中的内含物反应后被微球全部捕获，完成所有单微球对与其配对的单细胞的内含物的单独捕获；h、打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，邹远，张明霞，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35