用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法技术

本发明专利技术公开了用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法。本发明专利技术的LAMP引物是根据产气肠杆菌ThdF基因设计的六条特异性引物，应用上述六条引物，可实现特异性扩增，能够有效鉴别产气肠杆菌，最低检测极限可达到1个DNA拷贝；60min内可以完成对DNA样品的检测；且可根据实际情况灵活选择检测方法，方便快捷，有非常广阔的应用前景。

LAMP primer set, reagent kit and rapid detection method for detecting Enterobacter cloacae

The invention discloses a LAMP primer set, a reagent kit and a fast detection method for detecting Enterobacter cloacae. LAMP primer of the invention is based on six specific primers of Enterobacter aerogenes ThdF gene, using these six primers can achieve specific amplification, it can effectively identify Enterobacter aerogenes, the lowest detection limit can reach 1 copies of DNA; 60min can be completed within the sample of DNA detection and detection; the method is flexible, according to the actual situation to choose convenient, has very broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法
本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及用于检测产气肠杆菌的引物组、试剂盒及快速检测方法。
技术介绍
肠杆菌属现有15种，其中产气肠杆菌是最常见的一种，是肠道正常菌丛的一部分，认为不会引起腹泻，广泛存在于自然环境中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，但能引起多种肠道外的条件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和伤口感染，亦可引起菌血症和脑膜炎。传统的产气肠杆菌检测主要通过生化鉴定和普通PCR。其中，生化鉴定需要对细菌进行纯培养后配成相当浓度的菌液后加到商业化的生化鉴定板，前后需要时间在2天以上。普通PCR则需要变性-退火-延伸3个阶段，即反应过程需要专业PCR仪控温，扩增后需要电泳仪判读结果。这些耗时长、操作繁琐及需要昂贵的仪器设备的方法都限制了产气肠杆菌的现场检测的发展，因此，开发一种简便、快捷的产气肠杆菌的检测方法具有极大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测产气肠杆菌的引物组；本专利技术的另一个目的在于提供用于检测产气肠杆菌的试剂盒；本专利技术的另一个目的在于提供产气肠杆菌的快速检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：ThdF-F3:5’-GCGATCGTCACCGATATC-3’；ThdF-B3:5’-GGTAATCGGCAGCTTAGC-3’；ThdF-FIP:5’-CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC-3’；ThdF-BIP:5’-GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG-3’；ThdF-LF:5’-GCCTGCGGTATCGATGATAT-3’；ThdF-LB:5’-ATTGAACAGGCGGATCGG-3’。用于检测产气肠杆菌的试剂盒，包括上述的LAMP引物组。作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。作为上述试剂盒的改进，还包括以下成分：DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照。作为上述试剂盒的优选，反应液为含有20mMpH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。作为上述试剂盒的优选，荧光染料为SYBRGREENⅠ。作为上述试剂盒的优选，显色剂为SYBRGREENⅠ与钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。非疾病诊断目的的产气肠杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：（1）提取待检样品DNA；（2）利用上述的LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温荧光扩增或恒温扩增；所述恒温荧光扩增反应在qPCR仪器中进行，实时读取荧光信号；若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性；所述恒温扩增反应在恒温装置下进行，反应结束后加入1～2μL的显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现荧光黄绿色，则判断为阳性，若呈现橙色，则判断为阴性；上述方法所用的引物与试剂如前所述。作为上述检测方法的优选，所述恒温荧光扩增反应的25μL反应体系含有：ThdF-F30.02μM、ThdF-B30.02μM、ThdF-FIP0.16μM、ThdF-BIP0.16μM、ThdF-LF0.08μM、ThdF-LB0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA2μL、荧光染料0.5μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。作为上述检测方法的优选，所述恒温扩增反应的25μL反应体系含有：ThdF-F30.02μM、ThdF-B30.02μM、ThdF-FIP0.16μM、ThdF-BIP0.16μM、ThdF-LF0.08μM、ThdF-LB0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA2μL，用超纯水补齐到25µL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。本专利技术的有益效果是：（1）高特异性：本专利技术的LAMP引物是根据产气肠杆菌ThdF基因设计的六条特异性引物（2条内部引物FIP/BIP、2条外部引物F3/B3、2条环状引物LF/LB），应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；并且引物在反应体系用量仅10-2μM级，便可实现特异性扩增，能够有效鉴别产气肠杆菌。（2）高灵敏度：最低检测极限可达到1个DNA拷贝，灵敏度远高于目前现有技术公开的检测水平；（3）快速高效：60min内可以完成对DNA样品的检测；（4）可灵活选择检测方法：可根据实际情况灵活选择检测方法，恒温荧光扩增需额外配备qPCR仪器采集荧光信号，通过扩增曲线是否为“S”型来判断结果；而恒温扩增则无需大型设备，利用肉眼观察的显色反应，即可判断结果，其显色原理是利用钙黄绿素与锰离子结合处于淬火状态；扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。附图说明图1：实施例2的方法灵敏度评价结果，图中，标注的106、105、104、103、102、10、1为对应样品的质粒标准品拷贝数，control为DEPC水；图2：实施例3的方法灵敏度评价结果，图中，标注的106、105、104、103、102、10、1为对应样品的质粒标准品拷贝数，control为DEPC水；图3：实施例2的方法特异性评价结果，图中，positive（阳性样本）为20株产气肠杆菌；negative（阴性样本）共30个，分别为阴沟肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、摩氏摩根菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿链球菌、溶血葡萄球菌、鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、人体白细胞；图中negative（阴性样本）扩增曲线重叠在一起；图4：实施例3的方法特异性评价结果，图中，样品管上标注的1～20为20株产气肠杆菌；标注的Q1～Q30依次对应样品为阴沟肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、.普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、摩氏摩根菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、草绿链球菌、溶血葡萄球菌、鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、人体白细胞。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1、用于检测产气肠杆菌的试剂盒用于检测产气肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：ThdF‑F3: 5’‑GCGATCGTCACCGATATC‑3’；ThdF‑B3: 5’‑GGTAATCGGCAGCTTAGC‑3’；ThdF‑FIP: 5’‑CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC‑3’；ThdF‑BIP: 5’‑GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG‑3’；ThdF‑LF: 5’‑GCCTGCGGTATCGATGATAT‑3’；ThdF‑LB: 5’‑ATTGAACAGGCGGATCGG‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：ThdF-F3:5’-GCGATCGTCACCGATATC-3’；ThdF-B3:5’-GGTAATCGGCAGCTTAGC-3’；ThdF-FIP:5’-CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC-3’；ThdF-BIP:5’-GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG-3’；ThdF-LF:5’-GCCTGCGGTATCGATGATAT-3’；ThdF-LB:5’-ATTGAACAGGCGGATCGG-3’。2.用于检测产气肠杆菌的试剂盒，包括权利要求1所示的LAMP引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括以下成分：DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：反应液为含有20mMpH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：荧光染料为SYBRGREENⅠ。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：显色剂为SYBRGREENⅠ与钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。8.非疾病诊断目的的产气肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮勇宇，杨秋，李思，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东,44