结直肠癌的生物标记物制造技术

结直肠癌的生物标记物。涉及干扰素诱导的跨膜蛋白1在抑制结直肠癌中内源性逆转录病毒中的应用。用CRISPR/Cas9技术构建IFITM1‑KO的hESCs来研究IFITM1的功能。研究发现，IFITM1缺失的人胚胎干细胞(hESCs)在细胞增殖，细胞多能性，端粒长度，端粒酶活性等方面与IFITM1‑WT相差不多。IFITM1‑KO hESCs中人类内源性逆转录病毒表达升高，并且其在癌旁组织中表达比结直肠癌组织表达升高。通过ChIP‑qPCR检测，发现在IFITM1‑KO hESCs中H3K9me3在HERVs位点富集下降。这些数据表明在hESCs和结直肠癌中，IFITM1表达水平与HERVs表达呈负相关，IFITM1通过调控表观遗传来抑制HERVs的表达。

Biomarkers for colorectal cancer

Biomarkers for colorectal cancer. Application of interferon induced transmembrane protein 1 in the inhibition of endogenous retroviruses in colorectal cancer. Construction of IFITM1 KO using CRISPR/Cas9 technology to study the function of IFITM1 hESCs. The study found that human embryonic stem cells lacking IFITM1 (hESCs) on cell proliferation, cell pluripotency, telomere length and telomerase activity, IFITM1 and WT were not. The increased expression of human endogenous retrovirus IFITM1 KO hESCs, and the expression ratio of colorectal cancer increased expression in tumor tissues. Through the ChIP qPCR detection, found in the IFITM1 KO hESCs H3K9me3 at HERVs locus enrichment decreased. These data suggest that the expression of IFITM1 is inversely related to HERVs expression in hESCs and CRC, and that IFITM1 inhibits the expression of HERVs by regulating epigenetic inheritance.

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌的生物标记物
：本专利技术属于生物医学
，具体涉及基于检测IFITM1及其调控的HERVs相关基因的表达水平来诊断结直肠癌的方法。
技术介绍
：1.近年来，多项研究表明IFITM1在多种恶性肿瘤中高表达，如IFITM1在子宫颈癌、食管癌、卵巢癌、脑癌中均高表达，并且在结直肠癌中表达上调并被认为是结直肠癌分子标志物。越来越多人关注其在恶性肿瘤的发生发展及肿瘤早期侵袭中的作用。在结直肠癌中，其仅在肿瘤组织有IFITM1表达，在肠道肿瘤形成过程中Wnt/β-catenin信号通路的激活能诱导IFITM1的表达；在慢性髓系白血病中，其在高危组表达水平低，低危组表达水平高，表达水平高的患者具有更好的预后，因此，有人认为IFITM1可能是慢性髓系白血病患者预后的分子标志物。2.人内源性逆转录酶病毒(Humanendogenousretroviruses,HERVs)是可转座的遗传因子，可以插入人的基因组中，在人基因组中占到8％的比例。其在胚胎发育过程中被激活，IFITM1能保护胚胎和生殖细胞免受内源性逆转录酶病毒和外源性病毒的感染。ERVs包含有长的末端重复序列(LTRs)，能通过H3K9me3组蛋白修饰来抑制其表达，并且可以通过增加基因组DNA甲基化来抑制HERVs的表达。HERVs过表达会导致基因组不稳定，异常表达的HERVs甚至与癌症的发生相关联。3.前人研究中提议将IFITM1作为结直肠癌分子标志物，经过试验发现在结直肠癌中IFITM1的表达与HERVs表达呈负相关，本专利技术中以IFITM1及HERVs的表达作为双重标准来作为结直肠癌的标志物。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种IFITM1及其调控的HERVs在结直肠癌标记中的用途。具体说，本专利技术涉及IFITM1蛋白及其调控的HERVs在结直肠癌诊断试剂盒中的应用。本专利技术的实施能提供更加准确的结直肠癌的诊断。本专利技术的技术方案一种蛋白及其调控的基因即人内源性逆转录病毒在制备用于检测受试者中存在结直肠癌的体外方法中的试剂盒中的用途，该用途包括：检测该IFITM1及其调控的基因即人内源性逆转录病毒(HERVs)在受试者的测定细胞即结直肠活检测样品中的表达；将所述的测定值与参考值相比较，IFITM1明显高于参考值并且HERVs明显低于参考值，表明受试者可能患有结直肠癌。所述参考值水平是IFITM1和HERVs相关基因在正常细胞即结直肠活检测样品中的水平。所述正常细胞是相同受试者中与测定细胞相同类型的细胞。所述正常细胞是受试者中与测定细胞相同类型的细胞，所述受试者没有癌症。所述样品已知或被怀疑包含肿瘤细胞。1.本专利技术至少部分基于对在人结直肠中高表达的IFITM1及在结直肠癌肿瘤中普遍低表达的HERVs基因的鉴定。本专利技术的方法对于结直肠癌的检测有用。2.利用IFITM1和HERVs作为生物标记诊断结直肠癌。3.本申请所描述的方法可用于诊断受试者中的结直肠癌的存在。在一些具体实施方案中，所述的方法包括，从受试者获取样品，评估所述样品中IFITM1和HERVs存在和/或水平，将所述的存在和/或水平与一个或以上的参照相比较，例如代表正常IFITM1和HERVs水平的对照参照，如来自未受影响的受试者或来自相同个体的正常细胞的中的水平。4.样品：在本专利技术的方法的一些具体实施方案中，所述的样品是包括已知的或被怀疑的肿瘤细胞，例如是活检样品。在一些具体实施方案中，所述的样品是冷冻的，固定的和/或经渗透处理的,例如是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品或冰冻在液氮中的样品。5.检测的方法：a.可以使用本领域任何已知的方法来检测和/或定量本申请所述的生物标记的水平。例如可以利用本领域已知的方法评估IFITM1和HERVs的mRNA(转录物)的水平，例如Northern印迹,RNA原位杂交(RNA-ISH),RNA表达测定,例如微阵列分析,RT-PCR,RNA测序(例如利用随机引物或寡T引物),深度测序(deepsequencing)，克隆，Northern印迹，和扩增转录物,例如利用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。b.在一些具体实施方案中，可以检测IFITM1和HERVs编码的蛋白质的水平。可利用本领域已知的方法评估蛋白质的存在和/或水平,例如利用定量免疫分析方法，如酶联免疫吸附试验(ELISAs),免疫沉淀，免疫荧光，免疫组织化学，酶免疫测定(EIA),放射免疫测定(RIA)和Western印迹分析。c.在一些具体实施方案中，所述的方法包括使选择性地与生物标记结合的试剂与样品接触，以评估样品中所述生物标记，例如IFITM1及HERVs转录物/mRNA或蛋白质(例如寡核苷酸探针，抗体或其抗原结合部分)的水平。在一些具体实施方案中，所述的试剂带有可检测的标记。关于经标记的试剂，包括将所述试剂与可检测的物质相偶联(即物理连接)的直接标记，以及通过所述试剂与可检测的物质的反应性进行间接标记。可检测的物质的示例是本领域已知的，包括化学发光的，荧光的，放射性的或显色的标记。例如可检测的物质包括各种酶,辅基,荧光材料，发光材料，生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素，以及亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素,罗丹明),二氯三嗪氨荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein),丹磺酰氯，量子点(quantumdots)或藻红蛋白；发光材料的示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶，荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的示例包括125I,131I,35Sor3H。总体而言，可利用抗体检测蛋白质。抗体可以是多克隆抗体，更优选单克隆抗体。可应用完整抗体或其抗原结合片段(例如Fab或F(ab')2)。附图说明：图1是免疫荧光图和柱状图，通过免疫荧光和定量PCR实验证明IFITM1在结直肠癌肿瘤部位和hESCs(WA26和RUES2两个细胞系)中确实高表达。图2是包括免疫荧光图(D,E)，柱状图(G,I)，凝胶电泳图(H)，细胞形态图(C),曝光图片(B,F,J)。图2验证构建的IFITM1敲除细胞系，并检验IFITM1敲除后细胞变化。其中A显示CRISPR/Cas9敲除基因原理图。B,D鉴定IFITM1敲除细胞系。C显示IFITM1敲除后细胞形态无变化。F显示IFITM1敲除后干细胞多能性无明显变化。I,J显示IFITM1敲除后细胞端粒无明显变化。G,H显示IFITM1敲除后细胞端粒酶活性物明显变化。图3是柱状图，检测IFITM1敲除后细胞内HERVs的表达。其中A显示HERVs的结构，黑色箭头表明我们所设计定量PCR(ChIP-qPCR引物同定量PCR)引物的大致位点。B显示在hESCs中，IFITM1敲除后HERVs表达升高(P15代次)。C通过ChIP-qPCR实验说明在hESCs(RUES2)中，IFITM1敲除后H3K9me3在HERVs位点的结合下降(P15代次)。图4是免疫荧光图和散点图，检测IFITM1敲除后细胞内DNA甲基化变化情况。通过免疫荧光实验，并且统计细胞荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结直肠癌的生物标记物，涉及蛋白及其调控的基因即人内源性逆转录病毒在制备用于检测受试者中存在结直肠癌的体外方法中的试剂盒中的用途，该用途包括：检测该IFITM1及其调控的基因即人内源性逆转录病毒(HERVs)在受试者的测定细胞即结直肠活检测样品中的表达；将所述的测定值与参考值相比较，IFITM1明显高于参考值并且HERVs明显低于参考值，表明受试者可能患有结直肠癌。

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌的生物标记物，涉及蛋白及其调控的基因即人内源性逆转录病毒在制备用于检测受试者中存在结直肠癌的体外方法中的试剂盒中的用途，该用途包括：检测该IFITM1及其调控的基因即人内源性逆转录病毒(HERVs)在受试者的测定细胞即结直肠活检测样品中的表达；将所述的测定值与参考值相比较，IFITM1明显高于参考值并且HERVs明显低于参考值，表明受试者可能患有结直肠癌。...

【专利技术属性】
技术研发人员：付雨栋，王华，龚鹏，周忠诚，戚峰，刘林，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12