砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种的分子鉴定方法技术

本发明专利技术公开了用于砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种鉴定的SSR引物及方法。所用SSR引物为：正向引物：5’‑CAAATTCAGACGCTTCTTTTGG‑3’和反向引物：5’‑AGAATTGAGCAAAAAGGAGATGG‑3’，鉴定方法包括以下步骤：(1)提取供试南瓜幼苗叶片基因组DNA；(2)以南瓜基因组DNA为模板，使用SSR引物进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(4)对电泳结果进行分析，根据PCR扩增的特异性条带，若子代同时出现父本和母本的特异性条带，即为真正的杂交种；若子代只出现父本或母本的特异性条带，即为假杂交。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。

Molecular identification method of hybrid pumpkin \Wei anvil 1\ hybrid

The invention discloses a SSR primer and a method for identifying the pumpkin 'Wei anvil 1' hybrid species used for anvil. The use of SSR primers for the forward primer: 5 'CAAATTCAGACGCTTCTTTTGG 3' and reverse primer: 5 \AGAATTGAGCAAAAAGGAGATGG 3\, identification method comprises the following steps: (1) the extraction of pumpkin seedlings leaf genomic DNA; (2) the pumpkin genomic DNA as template for PCR amplification using the primers (SSR; 3) of amplified products were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis; (4) the electrophoresis results were analyzed according to PCR amplified specific bands, if the offspring appear at the same time the male and female parent specific bands, namely the hybrid offspring; if only male or female parent specific bands, i.e. false hybrid. The method has the advantages of fast, accurate, low cost and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种的分子鉴定方法
本专利技术涉及分子检测领域，一种快速、方便、准确、有效的检测砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种的分子鉴定方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
种子纯度，是保证品种优良性状得以展现的关键因素，也是种子质量控制中最棘手的问题。传统的田间生态学杂交种检验方法易受环境条件和栽培措施的影响，鉴定周期长，成本高，鉴定结果准确性差。随着分子辅助育种工具的快速发展，DNA分子标记已从很多方面优于传统的鉴定方法，可以弥补传统鉴定方法中存在的许多缺陷和难题，是对种子杂交种进行快速、准确鉴定的发展方向和必然选择。目前，SSR分子标记技术是现阶段用于鉴定杂交种的常用方法。SSR(Simplesequencerepeat，SSR)即简单重复序列是普遍存在于真核生物基因组中的一种重复序列。SSR标记属于微卫星标记，有很多优点，包括多态性高、共显性、重复性好、数量丰富、对基因组覆盖范围广以及操作简单易检测，因而成为构建遗传连锁图谱、遗传多样性检测、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测以及目标性状分子标记筛选的理想工具，已被广泛应用于基因定位及克隆、品种鉴定、农作物育种和进化研究等领域。砧用南瓜‘伟砧1号’是以‘SF1’为母本，‘S26’为父本育成的南瓜一代杂交种。具有与黄瓜亲和力强，高抗枯萎病，嫁接黄瓜增加瓜条亮度的特点，已经在设施黄瓜生产中大面积应用。为了保证优良杂交品种的推广和产生最大的经济效益，筛选出可以对南瓜‘伟砧1号’杂交种进行准确鉴定的SSR引物，以解决‘伟砧1号’在制种过程中导致制种纯度不高的问题，为种子生产经营企业提供了一个准确、稳定、快速、实用的‘伟砧1号’杂交种鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测‘伟砧1号’南瓜杂交种的引物序列。本专利技术目的还在于提供一种利用上述引物进行‘伟砧1号’南瓜杂交种的分子鉴定方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：(1)提取南瓜幼苗的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，从已获得的SSR引物中进行PCR扩增筛选出父本‘S26’与母本‘SF1’之间的特异性条带差异明显的引物NG22；(3)以砧用南瓜杂交种‘伟砧1号’的基因组DNA为模板，使用SSR引物NG22进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(4)对电泳检测结果进行分析：若子代同时出现父本和母本的特异性条带，即为真正的杂交种；若子代只出现父本或母本的特异性条带，即为假杂交种；附图说明图：SSR标记NG22在亲本及子代中的扩增结果，M为pBR322DNA/MspⅠ，1-6为‘伟砧1号’，7-8为父本，9-10为母本。具体实施方式为了能更加清楚的说明本专利技术的方法，下面对本专利技术的试验方法作以详细的说明，在此需加以说明的是：本专利技术所用到的试剂均有市售。(一)供试南瓜材料所用材料包括砧用南瓜杂交种‘伟砧1号’及其父本‘S26’和母本‘SF1’。(二)供试南瓜基因组DNA的提取(1)叶片采集：将供试南瓜材料播种于培养钵中，待三叶一心时期，取植株顶部较为幼嫩的叶片，在-80℃下保存备用。(2)取一片南瓜叶于1.5ml离心管中，在冰盒上充分研磨，加入600μl预热的2×CTAB缓冲液，10μl的β-巯基乙醇，轻轻混匀，65℃水浴1h(每隔10min轻轻摇晃一次)。(3)加等体积的氯仿，轻轻混匀，12000rpm离心10min，取上清于另一新的离心管中。(4)同上。(5)加入的等体预冷的积异丙醇，轻轻混匀，-20℃保存30min，12000rpm离心10min，弃上清。(6)70％乙醇洗涤沉淀2-3次，置于超净工作台风干。(7)加入50μl的ddH2O溶解。(8)DNA质量的检测：1％的琼脂糖凝胶电泳检测。(三)SSR分子标记引物的筛选从已获得的56个SSR引物中进行PCR扩增筛选出父本与母本之间的特异性条带差异明显的引物，即NG22。PCR反应体系与程序(1)PCR反应体系(2)PCR反应程序PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min。于4℃冰箱保存。PCR产物检测(3)12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增结果进行检测：凝胶组分(15ml)：150V电泳3h，关闭电源，对胶体水洗两次，10％乙醇固定10min，水洗两次，1％硝酸敏化5min，水洗两次，0.2％硝酸银染色30min，水洗两次，2％氢氧化钠显色至出现清晰目的条带，水洗两次，10％乙酸停显2min，水洗两次，拍照保存。如图所示，1-5：砧用南瓜‘伟砧1号’扩增出107bp和113bp两条带；6，7：父本‘S26’扩增出113bp的条带；8，9：母本‘SF1’扩增出107bp的条带。回收特异条带，送上海生物工程公司测序。杂交种中113bp条带的序列如SEQIDNO:3所示，107bp条带的序列如SEQIDNO:4所示，与父本、母本扩增产物的序列相符。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种分子鉴定的SSR引物NG22，其特征在于，上游引物：5’‑CAAATTCAGACGCTTCTTTTGG‑3’，下游引物：5’‑AGAATTGAGCAAAAAGGAGATGG‑3’，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种分子鉴定的SSR引物NG22，其特征在于，上游引物：5’-CAAATTCAGACGCTTCTTTTGG-3’，下游引物：5’-AGAATTGAGCAAAAAGGAGATGG-3’，所述上游引物核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.利用权利要求1中所述引物，检测砧用南瓜杂交种‘伟砧1号’的分子鉴定方法，其特征包括如下步骤：(1)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤梅，崔健，祝倩倩，刘素芹，宋云云，江志训，张伟丽，
申请(专利权)人：青岛科技大学，青岛市农业科学研究院，章丘伟丽种苗有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37