生产生物活性HIV‑1 TAT蛋白的方法技术

在大体积培养物中产生的Tat蛋白在常规光学密度下诱导时是没有活性的，但是在对数生长期过程中诱导时可以以生物活性形式获得。

Production method of biological activity of 1 TAT protein HIV

The Tat protein produced in large volume cultures is not active when induced by conventional optical density, but is induced in a biologically active form during the logarithmic phase of growth.

【技术实现步骤摘要】
生产生物活性HIV-1TAT蛋白的方法本申请是PCT申请号为PCT/EP2009/001198，中国国家阶段申请号为200980111208.8的专利技术专利申请的分案申请。原申请的专利技术名称为“生产生物活性HIV-1TAT蛋白的方法”，申请日期为2009年2月6日。本专利技术涉用于疫苗的生物活性HIV-1Tat、其衍生物和其前体，包括所有HIV-1分化体-特异性形式的生产。人免疫缺陷病毒(HIV)，即，AIDS的病原体，持续在世界范围内快速传播。WHO和UNAIDS估计自开始流行以来，已有超过六千万人感染了该病毒。在2004年年末，有超过四千万人，大部分生活在发展中国家，感染了HIV。发展中国家中HIV流行病的无情传播和由AIDS导致的发病率和死亡率加强对针对AIDS的有效、安全且廉价的疫苗的急需性。在过去的15-20年中，HIV疫苗开发中的大部分努力集中在通过利用产生能够防止感染的中和抗体(NA)的基本原理，靶向负责病毒结合和进入的HIV包膜蛋白(Env)而获得消除性免疫(Wahren，2002)。然而，来自临床前和临床试验的结果，包括最初的III期试验(VaxGen的AIDSVAX)，其中在白种人中没有观察到对原发性感染的保护作用，这些结果是非常令人失望的。这可以通过所述疫苗不能激发保护性NA来解释，其归因于Env的高可变性(Myers，1995)，并且阻止NA对相关的、主要是构象表位的识别；且还可以通过gp120的严重糖基化来解释，其有助于隐藏关键的(中和)env-表位(在Burton1997中综述)。最近以来，已经开发了其它方法，其目的是诱导针对其它HIV抗原的T细胞介导的反应。这些方法目的在于控制病毒复制，其在不存在消除性免疫的条件下实现，提供保护以避免疾病进展，并因此减少病毒传播至健康个体。然而，这些方法也都失败了。其中的一个实例是Merck最近基于三种HIV基因进行的试验。这种疫苗使用三种成分的混合物产生，每种成分用一种常见的感冒病毒，即5型腺病毒(Ad5)的复制缺陷型版本制成，所述5型腺病毒(Ad5)作用为HIVgag、pol和nef基因的载体或递送载体。该疫苗不能预防感染：在接受三剂量疫苗系列中的至少一剂量的志愿者中，在接受疫苗的741名志愿者中观察到24例HIV感染，在安慰剂组的762名参与者中观察到21例HIV感染。另外，该疫苗不减少被感染的那些人血流中的病毒的量；诊断感染后约8-12周的HIVRNA水平在疫苗和安慰剂组中相似。一种根本不同的方法是基于关键的HIV调控基因tat以及其蛋白产物tat作为疫苗候选物。作为非常早期的调控蛋白并且在HIV-1复制和发病机理中起着主要作用，Tat代表疫苗开发的最佳候选物(Ensoli，1990，1993和1994；Chang，1997)。Tat是一种在感染后非常早，甚至在HIV整合之前产生的重要的病毒调控蛋白，并且是病毒基因表达(Arya，1985；Fisher，1986；Ensoli，1993；Wu，2001)、以及细胞-到-细胞病毒传播和疾病进展所必需的。事实上，在不存在Tat时，没有或可以忽略量的结构蛋白得到表达，并且因此，不形成传染性病毒。此外，Tat由被感染的T淋巴细胞释放在细胞外环境中(Ensoli，1990和1993；Chang，1997)，并且进入感染的细胞和未感染的细胞，在感染的细胞中，其促进HIV-1复制，在未感染的细胞中，其引起控制细胞周期的细胞因子和细胞基因的激活或抑制(Frankel和Pabo，1988；Ensoli，1993；Chang，1995)。这一方法的目的在于诱导中和细胞外Tat的抗体和针对病毒感染的细胞的T细胞反应。一些研究表明针对Tat的免疫反应具有保护作用，并且可以在体内控制疾病的进展(Reiss，1990；Rodman，1993；Re，1995；Zagury，1998；Re，2001)。特别地，与疾病晚期阶段的患者相比较，在无症状HIV-感染个体中(Krone1988，Demirhan2000，Re2001)和与快速进展者相比较，在非进展者中(Zagury1998)，已经显示了更高的抗-Tat抗体流行性。我们最近在一组252名个体中进行了横向和纵向的研究，该组个体具有准确估测的血清转化日期和平均7.2年的随访(Rezza，待出版)。这一研究的结果揭示在抗-Tat抗体的存在和疾病的较缓慢进展之间的强相关性。事实上，对于抗-Tat阳性个体，发展AIDS或严重免疫缺陷的危险比抗-Tat阴性个体低60％。纵向分析还表明持久为抗-Tat阳性的个体具有最低的疾病进展危险，而持久为抗-Tat阴性的那些个体具有最高的发展严重免疫缺陷的危险。特别地，暂时为抗-Tat阳性/阴性的个体与持久为阴性的个体相比具有几乎70％更低的危险，这提供了抗-Tat抗体的存在预示较缓慢的疾病进展的证据(Rezza，待出版)。Tat的免疫原区在所有的表位M亚型中是保守的(B和T细胞)(Myers，1995)。实际上，我们最近的数据表明来自HTLVIIIB实验室-适应病毒株的分化体B毒株-来源(BH-10)Tat蛋白的有效交叉识别(Buttò，2003)，所述HTLVIIIB实验室-适应病毒株在约20年前(Ratner，1985)由在非洲传播并属于不同的HIV-1分化体的病毒感染的个体分离，由此反映出相对应的Tat区的高保守程度。具体地，来自主要感染了A，B，C和D以及较轻程度的F和GHIV-1亚型的意大利、乌干达和南非患者的血清以相似的水平(即，抗-Tat抗体的流行性和滴度)识别BH-10Tat蛋白。这一观察得到序列保守分析结果的进一步证实，这表明预测的Tat氨基酸序列在属于不同HIV-1分化体的不同传播病毒中是充分保守的，并且表现出与BH-10Tat序列相对较高程度的同源性(Buttò，2003)。在Tat的第一外显子编码的部分，并且特别是在1-58区，同源性特别高，在1-58区中包含Tat的功能结构域和大部分目前鉴定的B、T-辅助和CTL表位(Buttò，2003)。此外，使用来自相同BH-10Tat序列的线性肽对来自意大利、乌干达和南非患者的Tat-阳性血清的表位作图研究表明相同的识别模式，并且证实氨基末端区包含Tat的主要B细胞表位，尽管大部分抗-Tat抗体表现为构象抗体，其不取决于感染的病毒毒株(Buttò，2003)。这些发现表明Tat的总体性质在构象水平上也是保守的，并且提供有力的正式证据表明基于Tat的疫苗确实可以表现为针对HIV的“通用”工具，原因在于其能够诱导有效针对不同病毒分化体的广谱的免疫反应。我们已经通过在不同动物模型中进行的临床前研究证实了这一假说，所述不同的动物模型包括小鼠和食蟹猴，证明用生物活性Tat蛋白或tatDNA接种是安全的，引发广谱且特异性的免疫反应，并且最重要的是，在接种的猴子中诱导针对高度致病性病毒(SHIV89.6P)感染的长期保护，所述高度致病性病毒在这些猴子中引起AIDS和死亡(Cafaro，1999，2000和2001)。特别地，天然Tat蛋白诱导Th-1和CD8+CTLs细胞免疫反应和高滴度的抗-Tat抗体，并且阻断猿/人免疫缺陷病毒(SHTV)89.6P的原发性感染，这如由本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备生物活性Tat的方法，所述方法包括培养在诱导时能够表达Tat的宿主生物体，并且其中Tat的表达是在所述宿主生物体的对数生长期过程中诱导的。

【技术特征摘要】
2008.02.06 GB 0802224.61.用于制备生物活性Tat的方法，所述方法包括培养在诱导时能够表达Tat的宿主生物体，并且其中Tat的表达是在所述宿主生物体的对数生长期过程中诱导的。2.按照权利要求1的方法，其中生物活性的量度是Tat被单核细胞来源的树突细胞摄取的能力。3.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物体容易允许大体积培养。4.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物体是真核细胞。5.按照权利要求4的方法，其中所述宿主生物体是细菌或酵母。6.按照权利要求5的方法，其中所述宿主生物体是酿酒酵母(S.cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、或大肠杆菌(E.coli)。7.按照权利要求6的方法，其中所述宿主生物体是大肠杆菌BL21菌株。8.按照前述权利要求中任一项的方法，其中由培养的宿主获得的表达产物与本领域中已证明是生物活性的Tat相同，或基本上相同。9.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat为SEQIDNOs.2或3所示，或为其具有生物活性且与所述序列具有至少70％序列同源性的突变体或变体。10.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：芭芭拉·恩索利，毛罗·马格纳尼，
申请(专利权)人：国家高等卫生院，乌尔比诺大学，
类型：发明
国别省市：意大利,IT