CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用制造技术

本发明专利技术涉及CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用，属家蚕育种和基因工程技术领域。本发明专利技术将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中，实现了对锌指蛋白进行基因编辑探索基因功能的一套方法，为以后批量化的研究转录因子提供了一套有效的方法。

Application of CRISPR/Cas9 technique in gene mutation of Bombyx mori zinc finger protein

The invention relates to the application of CRISPR/Cas9 technology in the gene mutation of Bombyx mori zinc finger protein, and belongs to the field of silkworm breeding and gene engineering technology. The invention of CRISPR/Cas9 gene editing technology in obtaining silkworm zinc finger protein gene in the mutant, the realization of a zinc finger gene editing method to explore the function of gene of protein, for the study of transcription factor mass provides an effective method of.

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用
本专利技术涉及CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用，属家蚕育种和基因工程

技术介绍
家蚕(Bombyxmori)，完全变态的鱗翅目昆虫，是目前最重要的经济昆虫之一。养蚕缫丝的专利技术是中国人民对世界文明作出的卓越贡献。转录因子是家蚕中非常重要的基因，家蚕很多性状均受转录因子家族基因调控，研究各种转录因子的功能对家蚕育种和丝质改良以及作为生物反应器表达外源蛋白具有非常重要的意义。现代生物技术，包括转基因技术和测序技术等的快速发展，为传统蚕丝业带来新的发展机遇和广阔的前景，特别是CRISPR/Cas9系统，在生命科学领域可谓是掀起了一场全新的技术革命。在家蚕中已经成功应用CRISPR/Cas9系统对多个基因进行了基因编辑，但是还没有对转录因子基因相关的研究被报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为转录因子的研究提供一种可实施的方法，提供CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用。本专利技术的技术方案如下：利用CRISPR/Cas9技术获得家蚕锌指蛋白基因突变体的方法，从NCBI数据库中获得锌指蛋白基因(BGIBMGA014418-TA)全序列，获得CDS序列，预测活性结构域，并在其附近设计sgRNA位点，而后预实验检测起作用的靶位点，将起作用的sgRNA和cas9mRNA按1：1的比例混合后显微注射到家蚕卵中，用新鲜桑叶饲养孵化蚁蚕并观察表型，等到出现表型之后对有表型的蚕进行基因型检测，确定基因功能。所述sgRNA核心位点序列为cccAGATGCCTGACCCTAAGACT，cctGACCCTAAGACTTACAAACA或cctAAGAACGATCTACCAGATGA；核心位点序列三个小写碱基为PAM位点。所述sgRNA通过以下方法得到：步骤S1，获得家蚕锌指蛋白基因碱基序列，预测活性结构域，并在其附近设计sgRNA位点；步骤S2，在设计好的sgRNA核心位点序列前部加上T7启动子序列，在sgRNA核心位点序列后部加上与crRNA/tracrRNA互补的序列，得到完整的sgRNA5’端DNA片段；步骤S3，人工合成步骤S2中获得的DNA片段和80bp的crRNA/tracrRNA序列，两个片段变性退火延伸生成完整的sgRNADNA序列；步骤S4，步骤S3中获得的sgRNA脱氧核苷酸序列在体外转录成sgRNA核苷酸序列。所述Cas9mRNA通过以下方法得到：将Cas9载体采用NotI(NEB)线性化酶酶切，获得线性化的Cas9载体，然后应用体外转录试剂盒mMESSAGET7Kit将Cas9载体转录成有翻译活性的Cas9mRNA。进一步地，所述Cas9mRNA和sgRNA按1：1浓度混合，Cas9mRNA和sgRNA的浓度均为1000ng/ul。本专利技术的机理如下：本专利技术应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对家蚕进行了锌指蛋白基因敲除，首先确定多化品系nistari家蚕锌指蛋白基因序列，根据序列设计编码链和非编码链sgRNA靶位点，然后加上启动子和crRNA/tracrRNA保守序列，体外转录成sgRNA核苷酸序列；线性化cas9载体，得到cas9mRNA，将sgRNA和cas9mRNA共同注射到家蚕卵中，cas9mRNA在家蚕中进行表达得到cas9蛋白，sgRNA引导cas9蛋白到指定靶点，对基因进行定点切割，通过非同源重组的方式对锌指蛋白基因进行基因编辑，影响家蚕锌指蛋白基因的正常表达。因为锌指蛋白基因较小，很难进行大片段敲除，也很难进行检测，我们在活性结构域附近设计了3个位点，成功的筛选到了敲除了活性结构域的锌指蛋白基因突变体。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用在转录因子的功能研究中，实现对转录因子基因进行基因编辑，并成功敲除其活性结构域以研究其功能。附图说明图1为sgRNA结构和序列。T7promoter：T7启动子，20N区域为sgRNA可变序列，即PAM位点前的sgRNA核心序列。图2为锌指蛋白基因突变体检测上、下游引物序列。图3锌指蛋白基因敲除克隆检测。图4锌指蛋白基因敲除筛选出的纯合突变体基因序列。图5锌指蛋白基因敲除杂合突变体表型呈现多态性。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细说明。实施例1从silkDB家蚕数据库中获得家蚕锌指蛋白基因(基因编号为BGIBMGA014418-TA)，设计引物验证基因序列后获得Nistari谷氨酸合成酶基因序列。应用在线软件CRISPRdirect设计20bp的sgRNA核心序列，筛选出三个靶位点合成序列cccAGATGCCTGACCCTAAGACT，cctGACCCTAAGACTTACAAACA或cctAAGAACGATCTACCAGATGA分别在前面加上gaaattaatacgactcactataT7启动子序列，和与crRNA/tracrRNA互补的片段gttttagagctagaaatagc，人工合成为62bp的前引物，与后引物crRNA/tracrRNA经过PCR程序，获得完整的sgRNA序列，见图1。采用的试剂如表1所示。PCR反应条件如表2所示。表1sgRNA合成体系表2sgRNA合成PCR反应温度和程序应用qaigen公司的MinelutePCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，PCR纯化获得完整的sgRNA序列。具体步骤如下：1、100ulPCR产物，加500ulbufferPB，混匀；2、加入准备好的离心柱中，放置1min，12000×g离心1min；3、倒掉废液，加入750ulbufferPE,12000×g离心1min；4、空管离心1min；5、换新的1.5EP管加10ul灭菌水，静置1min，离心1min。获得的sgRNA序列即作为体外转录模版。sgRNA体外转录具体操作步骤参见MAXIT7TranscriptionKit(北京华夏远洋科技有限公司)按照表3反应体系加入相应试剂。表3sgRNA体外转录反应体系混匀，37℃孵育4h，加入1μLTURBODNase，混匀，37℃孵育15min,加入29μL水使反应体积达到50μL，加入5μL5MAmmoniumAcetate(乙酸铵)，混匀，加入3倍体积100％ethanol(乙醇)，混匀，放置-20℃2h，4℃离心20min，倒掉上清，用70％乙醇洗涤一次，4℃离心20min，倒掉上清，将沉淀晾干，加入适量水溶解，即为可用于注射的sgRNA，放入-80℃冰箱备用。Cas9质粒线性化使用NotI(NEB)酶对Cas9质粒进行线性化，Cas9线性化体系，如表4所示。表4Cas9线性化体系割胶回收，应用qaigen公司的胶回收试剂盒(QIAGelExtractionKit)进行回收，具体步骤参见试剂说明书,获得的线性化质粒即作为体外转录模版。Cas9体外转录具体步骤参见mMESSAGET7KitwithManual说明书按照表5反应体系加入相应试剂。表5Cas9mRNA体外转录混匀，37℃孵育3h，加入1μLTURBODNase，混匀，37℃孵育15min,加入30μL水使反应体积达到50μL，加入3本文档来自技高网...

【技术保护点】
CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用。

【技术特征摘要】
1.CRISPR/Cas9技术在获...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱亚楠，王文，相辉，董扬，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53