一种生物组织基质材料、制备方法及其用途技术

本发明专利技术提供一种生物组织基质材料、制备方法及其用途。所述生物组织基质材料的特征在于，包括细胞外基质，所述细胞外基质包括胶原纤维、生长因子和纤连蛋白。所述生物组织基质材料由小肠粘膜下层基质材料制成。所述制备方法的特征在于，包括以下步骤：脱细胞：脱细胞液包括胰蛋白酶和PBS溶液，所述脱细胞液还包括EDTA、EDTA‑2Na或EDTA‑4Na；在多频超声环境中用脱细胞液处理进行脱细胞，所述双频超声至少包含频率不同的两个超声频率。本发明专利技术对脱细胞工艺技术进行改进，得到的产品DNA残留量更低，免疫原性更低、抗感染能力更高、修复能力更强。

Biological tissue matrix material, preparation method and use thereof

The invention provides a biological tissue matrix material, a preparation method and an application thereof. The biological tissue matrix material is characterized by comprising an extracellular matrix comprising an collagenous fiber, a growth factor, and fibronectin. The biological tissue matrix material is made from small intestinal submucosa matrix material. In the preparation method, which comprises the following steps: acellular liquid comprises: acellular trypsin and PBS solution, the acellular fluid also includes EDTA, EDTA 2Na or EDTA 4Na; using acellular liquid treatment to remove cells in multi frequency ultrasonic environment, the dual frequency ultrasound contains at least the frequency of two different frequency. The invention improves the technology of removing the cell, the product has the advantages of lower DNA residue, lower immunogenicity, higher infection resistance and stronger repair capability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医用生物材料
，具体涉及一种生物组织基质材料、制备方法及其用途；更进一步地涉及免疫原去除后的生物组织基质材料、具体的处理方法和具体的应用。
技术介绍
在医学上使用的修补材料可分为四大类：第一类为不可吸收的聚酯补片、聚丙烯补片、膨化聚四氟乙烯补片；第二类为可吸收的聚羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸；第三类为复合补片；第四类为脱细胞外基质生物补片(ECM)。有文献报道，不可吸收材料的补片：聚酯补片，腹部切口疝病人应用材料修补并发症分析表明，复发率为34％，感染率为12％，肠梗阻为12％，最为严重是16％肠瘘发生率。聚丙烯补片，目前最常用的腹壁缺损修补材料，但也有许多缺点。首先，补片的表面比较粗糙，在用于腹壁全层缺损修补时，其与内脏器官直接接触，不仅可引起较严重的腹腔粘连，而且可能侵蚀肠壁，引起肠瘘；其次，进行大的腹壁缺损修补，后期的疤痕收缩会造成网片扭曲，其不规则的表面可能刺激并损伤周围组织，引起感染及皮肤窦道形成。可吸收类补片：聚羟基乙酸和聚乳酸羟基乙酸补片，在90天左右被完全吸收。临床上最早报道用于修补受伤的脾和肾。此类材料不能单独作为腹部疝永久性修补材料，可作为腹膜缺损修补材料和有污染创面的腹壁切口疝和缺损的暂时性修补材料，可以在不引起并发症的情况下临时恢复腹壁连续性，帮助患者度过疾病的危险期，再用不吸收补片进行二期修补。复合补片：为了减少术后疼痛和不适的感觉，2004年Yelimlies等报道了用β-葡聚糖包被的聚丙烯网作为假体治疗腹股沟疝的临床客观和主观指标。经过113例Lichtenstein手术和腹腔镜手术，初步结论用β-葡聚糖包被的聚丙烯网治疗腹股沟疝比传统聚丙烯网的治疗能明显减少手术后疼痛和不适的发病率，提高生活质量。细胞外基质补片：使用高分子材料后部分患者可能会出现浆液肿、感染、慢性疼痛、补片皱缩、肠粘连、肠梗阻、肠瘘和复发等问题。脱细胞的细胞外基质(AcellularExtracellularMatrix，AEM)是由同种或异种异体的组织采用脱细胞技术，去除能引起宿主免疫排斥反应的所有成分，完整保留了细胞外基质和立体支架结构，宿主细胞在支架上生长，分泌新的细胞外基质成分，形成自身组织，完成对缺损组织的修复和重建。此类型补片属于新发展起来的一种新型修补材料。基于组织工程学原理以动物组织为原料的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)材料是主要发展方向。ECM是由多种大分子物质如胶原、非胶原性蛋白、氨基聚糖、弹性蛋白等成分，按一定比例和结构建成的复杂的有机三维整体，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所和微环境，能够调节各种细胞的生长、形状、代谢、迁移、增殖和分化，进而调控组织和器官功能。组织缺损的一个严重后果是“土壤”——ECM的丧失，这也是机体自身无法实现组织修复和再生的原因。天然的ECM可以作为组织再生的“土壤”，是理想的组织修复材料。去除动物组织的细胞成分可以去除大部分的免疫原性，并保留ECM成分，可以开发出理想的生物修补材料。目前，已经用于临床的生物活性材料包括同种异体真皮、猪小肠粘膜下层、猪真皮、胚胎牛真皮等ECM材料。其中脱细胞小肠粘膜下层(smallintestinalsubmucosa,SIS)基质材料是目前学术界公认的最理想的组织修复材料。美国CookBiotechIncorporated的以猪小肠粘膜下层为原料的生物修补片(商品名：BiodesignSurgisis)在欧美国家已占据10-30％的生物修补片市场，并于2010年底进入我国市场。BiodesignSurgisis产品具有天然特有的ECM结构和组成，能够主动诱导组织再生，免疫原性低，组织相容性好，可降解等优势。但随着临床应用的增加，BiodesignSurgisis产品的问题也显现出来。临床研究显示：BiodesignSurgisis产品在临床应用中出现了不同程度的浆液肿、感染、慢性炎症反应、组织愈合不良等并发症，其中浆液肿发生率最高。并发症可能导致疾病的复发，甚至需要二次手术去除。另外，产品的抗感染能力以及不同批次的产品的稳定性和统一性较差。一方面，动物源DNA残留是BiodesignSurgisis产品的主要缺点。BiodesignSurgisis的生产工艺并没有考虑到清除DNA残留的环节，其产品标准也未规定DNA残留控制的内容(参考标准：YZB/USA0944-2010)。研究已证实，浆液肿是由TH2炎性细胞因子反应引起的，而该反应就是由动物源DNA的慢性免疫反应所导致。另一方面，BiodesignSurgisis产品采用普通杂交系猪作为动物源，杂交系动物遗传背景的个体差异导致了不同批次产品的不稳定性和不统一性。再一方面，BiodesignSurgisis产品采用的成型工艺使SIS基质材料的空间结构压缩，破坏了天然的ECM三维结构，影响产品的抗感染能力和促进组织再生能力。
技术实现思路
基于以上现有技术，本专利技术提供一种生物组织基质材料，对现有生物修补片的脱细胞工艺技术进行改进，使本专利技术生物组织基质材料与现有产品相比，DNA残留量更低，免疫原性更低、抗感染能力更高、修复能力更强。为实现上述一个或多个目的，本专利技术提供一种生物组织基质材料，该材料包括细胞外基质，所述细胞外基质包括胶原纤维、生长因子和纤连蛋白(fibronectin，FN)。本专利技术所述的细胞外基质(小肠粘膜下层基质材料)由小肠粘膜下层组织材料(小肠粘膜下层)制成。本专利技术所述的小肠粘膜下层组织材料为哺乳动物的小肠粘膜下层组织材料。本专利技术所述的小肠粘膜下层组织材料为猪或牛的小肠粘膜下层组织材料。本专利技术所述的细胞外基质中动物源DNA残留量(动物源性生物材料DNA残留量)小于10ng/mg，优选小于3ng/mg，α-Gal抗原清除率不低于99％。DNA和α-Gal是抗原，如果生物材料中这些物质含量过高，放入人体后会使人体发生免疫排斥反应，而上述含量的有效控制克服了上述免疫排斥反应的缺陷，上述这些物质的去除是通过脱细胞步骤实现的。本专利技术还提供一种上述生物组织基质材料的制备方法，步骤包括：(1)原料的初处理：取小肠粘膜下层组织材料，清洗，滤干；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料，进行病毒灭活；(3)在超声环境下清洗由步骤(2)得到的小肠粘膜下层组织材料，然后滤干；(4)脱细胞：在超声环境中用脱细胞液处理进行脱细胞；(5)在超声环境中进行清洗，得到小肠粘膜下层基质材料。本专利技术步骤(2)的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％(用水配置成溶液)，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，灭活的温度范围为10-40℃。本专利技术步骤(3)的清洗过程中，采用清洗液清洗小肠粘膜下层组织材料，清洗液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为(20-40)︰1；然后采用纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率优选40kHz，功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物组织基质材料，其特征在于，包括细胞外基质，所述细胞外基质包括胶原纤维、生长因子和纤连蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种生物组织基质材料，其特征在于，包括细胞外基质，所述细胞外基质包括胶原纤维、生长因子和纤连蛋白。2.根据权利要求1所述的生物组织基质材料，其特征在于，所述的细胞外基质由哺乳动物的小肠粘膜下层组织材料制成，优选猪或牛的小肠粘膜下层组织材料。3.根据权利要求1或2所述的生物组织基质材料，其特征在于，所述的细胞外基质中的动物源DNA残留量小于10ng/mg，α-Gal抗原清除率不低于99％，优选地，所述的细胞外基质中的动物源DNA残留量小于3ng/mg。4.一种生物组织基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原料的初处理：取小肠粘膜下层组织材料，清洗，滤干；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料，进行病毒灭活；(3)在超声环境下清洗由步骤(2)得到的小肠粘膜下层组织材料，然后滤干；(4)脱细胞：脱细胞液包括胰蛋白酶和PBS溶液，所述脱细胞液还包括EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na；在多频超声环境中用脱细胞液处理步骤(3)得到的小肠粘膜下层组织材料，进行脱细胞；(5)在超声环境中将步骤(4)获得的脱细胞小肠粘膜下层组织材料进行清洗，得到脱细胞小肠粘膜下层基质材料。5.根据权利要求4所述的生物组织基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(5-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃；所述步骤(4)脱细胞液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na的浓度为0.1-1mmol/L，脱细胞液的pH值为7.0-8.0；所述脱细胞液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，脱细胞过程在双频超声波装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，低频处理5-40min；高频频率为60-90KHz，高频处理5-40min，脱细胞液的温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上。6.根据权利要求4或5所述的生物组织基质材料的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵博，王洪权，赵延瑞，李学军，张晋辉，
申请(专利权)人：北京博辉瑞进生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11