一种检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物及检测方法与检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测鉴定猪圆环病毒3型（PCV3）的PCR引物及检测方法与检测试剂盒。本发明专利技术通过参考比对猪圆环病毒3型的基因组序列，根据猪圆环病毒3型cap蛋白上的保守序列，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR引物，所述PCR上下游所述引物PCV3‑F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；并提供了一种猪圆环病毒3型PCR检测方法及试剂盒。本发明专利技术的引物和检测方法能快速、方便、高效地检测鉴定猪圆环病毒3型，特异性好，灵敏度高且检测方法操作简便高效，便于临床检测和方便开展流行病学调查，具有较大的应用前景。

PCR primer for detecting and identifying porcine circovirus type 3, detection method and detection kit

The invention discloses a PCR primer for detecting and identifying porcine circovirus type 3 (PCV3), a detection method and a detection kit. Through the compare of porcine circovirus type 3 genome sequence, according to the cap protein of porcine circovirus type 3 on the conserved sequence of PCR primers was designed for detection of porcine circovirus type 3, the sequence of PCR upstream and downstream of the primer PCV3 F/R such as SEQ ID NO.1 in ~ SEQ ID NO.2 shown; and provides a porcine circovirus type 3 PCR detection method and kit. The primers and the detection method of the invention can be fast, convenient and efficient detection and identification of porcine circovirus type 3, specificity, high sensitivity and the detection method is simple and efficient, easy and convenient to carry out epidemiological investigation and clinical detection, which has wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物疾病卫生检验
，具体地，涉及一种检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物及检测方法与检测试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒属于圆环病毒科，是猪病原体中最小的一种病毒。目前已知有两种圆环病毒能够感染猪，包括：猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型。其中，猪圆环病毒2型（PCV2）感染能导致各种临床疾病，从而导致世界猪肉业巨大的经济损失，而相反，猪圆环病毒1型（PCV1）则不致病。猪圆环病毒感染后的潜伏期均较长，即使是胚胎期或出生后早期感染，也多在断奶后陆续出现临诊症状。研究发现，PCV2可引起以下疾病，包括猪断奶后多系统衰弱综合征（PMWS），皮炎与肾病综合征（DNS），仔猪先天性震颤（CT），增生性坏死性间质性肺炎以及繁殖障碍等。2015年，Phan，Palinski等通过宏基因组测序在美国检测到一种新的猪圆环病毒：猪圆环病毒3型（PCV3）。感染这种病毒的猪常伴有猪皮炎肾病综合征，生殖衰竭，心脏和多系统炎症等症状。而目前，我国尚未有相关PCV3研究进展的报道，也未曾有检测鉴定猪圆环病毒3型的方法或试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有猪圆环病毒3型检测鉴定方面存的缺陷和不足，通过参考比对猪圆环病毒3型的基因组序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR|引物，所述引物能快速、方便、高效地检测鉴定猪圆环病毒3型，特异性好，灵敏度高。本专利技术的目的是提供一种鉴定检测猪圆环病毒3型的PCR引物。本专利技术另一目的是提供利用上述PCR引物来检测鉴定猪圆环病毒3型的方法。本专利技术的再一目的是提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一对检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物，所述PCR上下游引物PCV3-F/R的序列依次如SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示：上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’（SEQIDNO.1）；下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’（SEQIDNO.2）。本专利技术发现猪圆环病毒3型编码两个主要的开放阅读框：rep和cap，两者处在DNA链上相反的方向。通过参考与比对GenBank中所有PCV3cap基因序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR引物，通过对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猪圆环病毒3型，且特异性好，灵敏度高。所述引物PCR引物可用于检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型；或用于检测和/或鉴定猪圆环病毒3型。一种利用上述PCR引物检测鉴定猪圆环病毒3型的方法，包括如下步骤：S1.提取待测样品DNA；S2.以步骤S1所述DNA为模板，以权利要求1所述引物进行PCR反应；S3.将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型；优选地，所述PCR的反应体系为：2×TaqMasterMix10µL，DNA模板2µL，10µmol/LPCV3-F1µL，10µmol/LPCV3-R1µL，ddH2O加至20.0µL。更优选地，所述2×TaqMasterMix所含成分浓度为：TaqDNAPolymerase(recombinant)0.05units/µL，MgCl24mM，dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)0.4mM。优选地，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10min。优选地，所述电泳检测为取8μLPCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。优选地，所述结果判断的标准为：当PCR产物在267bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则表明待测样品中含有猪圆环病毒3型。上述检测方法在检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型方面的应用；或在检测和/或鉴定猪圆环病毒3型方面的应用均在本专利技术保护范围内。同时，本专利技术还提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述PCR引物。优选地，所述试剂盒还包含待测样品DNA提取所需试剂与PCR扩增所需试剂。更优选地，所述试剂包括PCR缓冲液，TaqDNAPolymerase(recombinant)，MgCl2，dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，ddH2O。优选地，所述试剂盒中还包含猪圆环病毒3型的核酸模板，即阳性对照。优选地，所述试剂盒还包括阴性对照；所述阴性对照为除去猪圆环病毒3型之外的其他种类的猪病毒的DNA或cDNA。更优选地，所述阴性对照为猪流行性腹泻病毒，猪塞内加谷病毒，口蹄疫病毒，猪德尔塔冠状病毒，猪库布病毒，猪博卡病毒或猪萨佩罗病毒中的一种或多种的DNA或cDNA。作为一种可选择的实施方式，所述检测试剂盒的使用方法具体如下：（1）用DNA抽提试剂对待测样品进行DNA抽提；（2）以步骤（1）的DNA为模板，以本专利技术所提供的猪圆环病毒3型PCR引物进行扩增，所述PCR扩增引物为：上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’所述PCR扩增反应体系为：扩增反应的总体积为20.0µL，其各种成分分别为：2×TaqMasterMix10µL，DNA模板2µL，10µmol/LPCV3-F1µL，10µmol/LPCV3-R1µL，ddH2O加至20.0µL。所述PCR扩增反应过程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10min。（3）扩增产物的鉴定：取8μLPCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。。紫外灯下观察PCR产物，若PCR产物在267bp处有明显发亮条带且阴性对照无条带，则显示为对猪圆环病毒3型呈阳性反应，即待测样品中含有猪圆环病毒3型。本专利技术所提供的猪圆环病毒3型的检测方法操作简便高效、PCR引物特异性高，便于临床检测和方便开展流行病学调查。所开展的收集广东地区26份疑似仔猪CT病料，进行检测后发现其中2份为阳性，表明该毒在我国广东地区已有所传播。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的猪圆环病毒3型检测引物及方法，操作简便、高效、PCR扩增特异性好、灵敏度好，应用于猪圆环病毒3型的PCR检测中的最低检测浓度限值可达到11.958ng/µL，便于临床检测和方便开展流行病学调查，具有较大的应用前景。附图说明图1为猪圆环病毒3型PCR电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000DLDNAMarker；1：猪圆环病毒3型阳性样品，2：空白对照。图2为猪圆环病毒3型特异性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000DLDNAMarker；1：猪圆环病毒3型；2：猪水泡病毒，3：口蹄疫病毒；4：猪流行性腹泻病毒；5：猪塞内加谷病毒；6：猪德尔塔冠状病毒；7：猪库布病毒；8：猪博卡病毒；9：猪萨佩罗病毒。图3为猪圆环病毒3型敏感性检测电泳结果图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物，其特征在于，PCR上下游引物PCV3‑F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一对检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物，其特征在于，PCR上下游引物PCV3-F/R的序列依次如SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示。2.一种利用权利要求1所述PCR引物检测鉴定猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测样品DNA；S2.以步骤S1所述DNA为模板，以权利要求1所述引物进行PCR反应；S3.将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：2×TaqMasterMix10µL，DNA模板2µL，10µmol/LPCV3-F1µL，10µmol/LPCV3-R1µL，ddH2O加至20.0µL。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝天，马静云，孙媛，麦凯杰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44