用于检测查加斯病的抗原组合物制造技术

本发明专利技术涉及由三种多肽1F8、JL7和Cruzipain组成的适用于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫(

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测查加斯病的抗原组合物查加斯病是由鞭毛虫原生动物克氏锥虫(Trypanosomacruzi)引起的热带寄生虫病。克氏锥虫通常通过昆虫载体(即锥猎蝽亚科(subfamilyTriatominae)(猎蝽科(familyReduviidae)，德文：“Raubwanzen”)的吸血“亲吻虫”)传播给人类和其他哺乳动物。该疾病也可通过输血和器官移植、摄入被寄生虫污染的食物传播以及从母亲传播到胎儿。克氏锥虫以不同形式和发育阶段出现。繁殖形式被称为短膜虫期(epimastigote)，其恰好在接吻虫已经在包括人类的被感染的动物上吸血后适应。短膜虫移动到该虫的直肠细胞壁上。该虫在随后的吸血（其中该虫排便）中经由其粪便将病原体转移至下一宿主。感染形式被称为锥鞭毛体，并通过咬伤进入人体。因此，可以在人血中发现锥鞭毛体。发现的另一种形式(例如在心肌细胞的细胞质中发现的另一种形式)称为无鞭毛体或微鞭毛体(micromastigote)。在克氏锥虫的生命周期期间，无鞭毛体变为锥鞭毛体，其可以在下一次吸血中被亲吻虫吸入。查加斯病的症状在感染过程中有所不同。通常存在急性期，随后是慢性期。感染后也可存在潜伏期。各期可以无症状或威胁生命。在早期、急性期，症状通常是轻度的，通常在感染部位仅仅产生局部肿胀。初始急性期对抗寄生虫治疗有反应，治愈率为60-90％。4-8周后，具有活动性感染的个体进入查加斯病的慢性期，其对于慢性感染个体的60-80％在其整个寿命中无症状。在慢性期期间，一些患者发生心脏并发症，导致心脏扩大、心力衰竭、心率改变和猝死。导致进食或通便困难的肠道并发症也是慢性期典型的。抗寄生虫治疗也似乎延缓或预防疾病慢性期期间的疾病症状的发展，但根据美国疾病控制与预防中心，发展这些并发症中的一种或多种的平均寿命风险为约30％，这意味着这些慢性感染的个体仍将最终发展威胁生命的心脏和消化系统病症。目前可用的查加斯病的抗寄生虫治疗是苄硝唑和硝呋莫司，其可以在许多患者中引起临时副作用，包括皮肤病症、脑毒性和消化系统刺激。查加斯病主要出现在墨西哥、中美洲和南美洲的贫困农村地区；非常罕见地，该疾病在美国南部被发现。然而，通过这些国家的体外诊断方法，筛选献血者被克氏锥虫的感染。如今几种血清学诊断方法可用来检测克氏锥虫的感染，例如，通过间接免疫荧光、间接血细胞凝集、补体固定、免疫印迹技术和ELISA检测针对克氏锥虫的抗体。还应用分子生物学方法(例如PCR)和复杂的媒介生物诊断方法。在媒介生物诊断法中，使载体传播的感染物，实验室培育的、无病原体昆虫(此处为：接吻虫)从患者吸取血液。然后检查昆虫的肠内容物中病原体(此处为：克氏锥虫)的存在。这些方法中的每一种在灵敏度和特异性方面都显示出其自身的弱点和优势，因此目前还没有可用的金标准方法。在开始开发查加斯测定法用于检测抗体中，应用了且仍正在使用天然抗原裂解物。然而，使用裂解物，在该抗原组合物中仅代表克氏锥虫的三个发育阶段之一，使得存在错过其他两个阶段的感染的特定可能性。更现代的测定法应用代表克氏锥虫感染的所有阶段的重组抗原的混合物。当使用天然抗原裂解物时，诊断测定法经常面临在另一种寄生虫利什曼原虫感染的患者样品中观察到的特异性和交叉反应性中的问题。此外，由于克氏锥虫的复杂抗原组成，抗原裂解物的产生导致相当大的批次间变化。此外，非常经常地，基于天然裂解物的稀有试剂显示弱灵敏度，因为一些裂解物完全不含或不含足够的所有生命周期阶段的抗原。通过应用重组抗原，可以规避或避免上述挑战。然而，基于重组抗原组合物的用于检测查加斯病的商购测定试剂盒在灵敏度和特异性方面显示相当大的差异，使得客户(即商业或临床实验室或血液筛选单元)通常必须并行使用几个试剂盒以获得可靠的结果。因此，关于患者样品是否反应的决定基于通过几种基于不同抗原组合物的试剂盒对相同样品获得的阳性或阴性结果的大部分。显而易见的是，应用多种诊断测试的该耗时程序在经济上没有意义，因为其导致实验室设备和个人、时间、工作量和成本的增加。用于检测针对克氏锥虫抗原的抗体的血清学测定已经在现有技术文献中广泛描述，对于综述，参见例如Silveira等人TrendsinParasitology2001,Vol.17No.6。已经由几个实验室分离了与血清诊断相关的克氏锥虫重组抗原。这些基因中的几个具有串联重复序列。由于克氏锥虫表达的抗原蛋白数量极大(公共数据库中近似23000个预测的蛋白编码序列和假基因)，所以用于免疫测定的抗原的可能组合的数量非常巨大。尽管重组生产的方法已经知道了几十年，但仍然存在找出建立诊断测定法需要何种抗原的挑战。选择用于免疫诊断测定的合适抗原，必须记住考虑病原体的所有生命周期阶段的抗原，并且还应用这样的抗原，针对其的抗体可以在所有感染阶段(急性、窗口和慢性期)发现。同时，因为技术考虑(例如缺乏溶解性和稳定性，导致信号淬灭的不必要的交叉反应，避免与例如利什曼原虫的交叉反应性)以及还有经济考虑(因为每种抗原此外需要大规模开发、评估和生产)，抗原的数量不应超过约5或10。据Silveria等人(同上)，商购的测定法通常使用六种或七种不同的克氏锥虫抗原的组合，有时也与源自克氏锥虫全长抗原的较短合成肽组合。提供高度灵敏的诊断测试的另一种方法基于多组分测定法，其应用大量已单独包被在分开珠粒上的各种克氏锥虫抗原。WO2009/017736和美国专利号8,329,411公开了用于检测生物样品中克氏锥虫感染的装置和方法。该设置包括16种不同的蛋白(选自最初的59种候选蛋白，其充当抗原)，其必须单独包被在标记的珠粒上，提供阵列样诊断工具。抗体，如果存在于样品中，则与这些包被的蛋白结合。因此，通过标记的二抗与样品抗体的结合来检测结合的抗体。尽管该程序对于研究方法有意义，但导致大量生产成本的大量抗原太昂贵，不能用作商业或临床实验室中的常规测定法。总之，本领域中已知用于检测来自感染个体的样品中的克氏锥虫抗体的免疫测定法应用大量不同的抗原来实现高灵敏度和特异性。仍然没有真正的金标准和经济实惠的测定法可用。因此，在提供这样的诊断组合物和方法时可以看到问题，所述诊断组合物和方法克服了用于检测克氏锥虫感染的现有技术测定法的重现性、灵敏度和特异性方面的缺点。该问题通过如权利要求中所指定的本专利技术来解决。专利技术概述本专利技术涉及适用于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫(Trypanosomacruzi,T.cruzi)的抗体的多肽的组合物，其包含多肽1F8、JL7和至少一种选自Cruzipain、KMP-11和PAR2的多肽。本专利技术的一个进一步方面是适用于检测克氏锥虫抗体的多肽的组合物，其中多肽1F8包含SEQIDNO.1，多肽JL7包含SEQIDNO.2，且至少一种选自Cruzipain、KMP-11和PAR2的多肽包含至少一种选自SEQIDNO.3(Cruzipain)、SEQIDNO.4(KMP-11)和SEQIDNO.5(PAR2)的序列。具体而言，本专利技术聚焦于多肽的组合物，其由三种重组或合成产生的对克氏锥虫特异性的多肽组成，其中所述多肽为1F8、JL7和Cruzipain。所述组合物中的多肽是1F8(其包含SEQIDNO.1)、多肽JL7(其包含SEQIDNO.2)和C本文档来自技高网...

【技术保护点】
适用于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫的抗体的多肽的组合物，所述组合物由三种重组或合成产生的对于克氏锥虫特异性的多肽组成，其中所述多肽为1F8、JL7和Cruzipain。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.06 EP 14192004.11.适用于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫的抗体的多肽的组合物，所述组合物由三种重组或合成产生的对于克氏锥虫特异性的多肽组成，其中所述多肽为1F8、JL7和Cruzipain。2.根据权利要求1所述的多肽的组合物，其中多肽1F8包含SEQIDNO.1，多肽JL7包含SEQIDNO.2且多肽Cruzipain包含SEQIDNO.3。3.根据权利要求1或2所述的多肽的组合物，其中所述组合物含有浓度为0.1至10毫摩尔/升的钙离子。4.产生由三种重组产生的多肽组成的适用于检测针对克氏锥虫的抗体的多肽的可溶性和免疫反应性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含可操作连接的编码第一克氏锥虫多肽1F8的重组DNA分子，b)表达所述克氏锥虫多肽，和c)纯化所述克氏锥虫多肽，d)用表达载体重复步骤a)至d)，所述表达载体包含可操作连接的编码第二克氏锥虫多肽JL7的重组DNA分子e)用表达载体重复步骤a)至d)，所述表达载体包含可操作连接的编码第三克氏锥虫多肽Cruzipain的重组DNA分子f)形成步骤c)、d)和e)中获得的克氏锥虫多肽的混合物，从而产生适合于检测针对克氏锥虫的抗体的多肽的可溶性和免疫反应性组合物。5.用于检测分离的样品中的对于克氏锥虫特异性的抗体的方法，其中根据权利要求1至3中任一项所述的克氏锥虫多肽的组合物或通过权利要求4的方法获得的克氏锥虫多肽的组合物用作所述克氏锥虫抗体的捕获试剂和/或结合配偶体。6.用于检测分离的样品中的对于克氏锥虫特异性的抗体的方法，所述方法包括a)通过将体液样品与根据权利要求1至3中任一项所述的克氏锥虫多肽的组合物或与通过权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：P明希，D罗斯勒，C肖尔茨，B乌普迈尔，T扎尔恩特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH